Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

이 프로토콜은 자신의 주변의 세포외 기질에서 발표가 되려면 여러 phenotypes로 차별화에 시달릴 수도 줄기 세포의 고유 기능을 활용에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 원고는 동시에 지방 파생 줄기 세포를 공동으로 차별화하는 데, PEG-섬유소와 콜라겐으로 구성되어 bilayered 히드로겔을 활용 모델, 우리의 설명 및 특성을 확장

Abstract

년간 천연 고분자로 인해 자신의 호스트 biocompatibility 및 시험 관내 및 생체내의 세포와 상호 작용하는 능력의 중요성을 얻고있다. 재생 의료의 가능성을 가지고 연구의 영역이 소설 biomaterials 및 줄기 세포의 조합을 사용합니다. 조직 공학 분야의 기본적인 전략은 세포 기능을 감독을위한 입체 비계 (예 : 세포외 기질, hydrogels, 마이크로 / 나노 입자를 decellularized)의 사용이다. 이 기술은 세포, 그들은 고수 수있는시 기판이 필요 분아 따위에 의해 중식, 그들의 차별화된 세포 표현형 및 기능 2-3 표현하는 발견으로 변화시켰습니다. 최근에는, 그것은 또한 세포 부착에 대해 이러한 기판을 사용할뿐만 아니라 상호 작용 및 매트릭스 기판 (예 : 세포외 기질, ECM) 4에서 단서를뿐만 아니라 결정되었습니다. 따라서 세포 공사장 공중 발판은 상호 연결조직 개발, 조직, 그리고 궁극적인 기능을 제어하는​​ 역할을합니다. 지방 파생 줄기 세포 (ASCs)가 mesenchymal가 아닌 hematopoetic 줄기 세포 멀티 혈통 차별을 전시하고 세포 즉시 사용할 소스 (예 : 사전 혈관 endothelia 및 pericytes)으로 사용할 수있는 지방 조직에 존재한다. 우리의 가설은 지방 파생 줄기 세포가 bilayered 매트릭스 1에 간단히 공동 culturing 그들에 의해 동시에 phenotypes 서로 다른 방향으로 이동 수있다는 것입니다. 저희 실험실은 피부 상처 치유에 초점을 맞추었습니다. 이를 위해, 우리는 피부에 특정한 상처 치유 ECM 환경의 특성과 기능을 모방 수있는 하나의 복합 천연 biomaterials의 행렬, 섬유소, 콜라겐과 키토산을 만들었습니다.

Protocol

1. 지방 파생 줄기 세포 (ASCs) 1, 5를 분리해

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

  1. 쥐 perirenal 및 epididymal 지방 격리하고 앞에서 설명한 5로 1퍼센트 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 무균 행크의 버퍼 소금 용액 (HBSS)으로 씻는다. 이 연구는 동물 복지 법, 구현 동물 복지 규정 및 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드의 원칙에 따라 준수 실시되었습니다.
  2. 조직을 말하다하고 실온에서 8 분 500g에서 50 ML 튜브 및 원심 분리기로 1퍼센트 FBS가 포함된 HBSS의 25 ML에 1-2g을 전송.
  3. 자유 부동 지방 조직 계층과 125-ML Erlenmeyer 플라스크에 송금을 모아서 37시 45 분 대한 HBSS에서 collagenase 2 형 (200 U / ML)의 25 ML ° 궤도 흔드는 (125 RPM)에서 C로 취급합니다. 조심스럽게 pipeting에 의해 액체 분획을 (오일과 지방 레이어 아래)을 제거하고 100를 통해 순차적으로 그것을 필터링 - μm의 70 - μm의 나일론 메쉬 필터. 상온에서 10 분 동안 500g에 여과물을 원심 분리기, 뜨는을 대기음, 그리고 HBSS의 25 ML로 두 번 펠릿 씻는다.
  4. MesenPRO RS 형성제 (페니실린 G의 100 U / ML, 100 μg / 스트렙토 마이신 황산의 ML과 amphotericin의 0.25 μg / ML 항생제 - antimycotic으로 보충 성장 매체 (MesenPRO RS 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간)의 50 ML에 세포 펠렛을 Resuspend 이 T75 flasks (25 ML / 플라스크)에 L-글루타민 및 피펫 전지의 B), 그리고 2 음.
  5. 문화 37 5 % CO 2-humidified 인큐베이터에서 ASC ° C (통로 2-4 ASCs가 모든 실험에 사용됩니다.)

2. 키토산 Microspheres (CSMs)를 준비

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

    5를 사용하여 이온 coacervation 기법과 함께 워터 인 오일 유화 과정에서 준비가되어 있습니다. 콩 기름, N-octanol (1시 2분 V / V)과 5으로 구성된 오일 위상 혼합물의 100 ML에 키토산의 수용액 (초산 0.5 M의 3% W / V 키토산 6 ML)를 유상으로 만들다 % 솔비 탄 모노-oleate (폭 80) 유화제, 반대 방향으로 동시에 오버헤드 (1700 RPM) 및 자기 저어 (1000 RPM)를 사용. 가교가 발생하기 전에 조기에 형성 micelles이 용액에 남아있을 수 있고 바닥에 정착하지 않는 혼합 보장이 이중 방식입니다. 또한,의 자석 볶음 바 AIDS 마이셀 형성 및 rigidization 동안 키토산을 취소 수렴.
  1. 혼합물은 지속적으로 안정적인 물 인 석유 유제를 얻을 때까지 약 1 시간 동안 흔들 저어. 4 H (24 ML 합계)에 대한 N-octanol 매 15 분 안에 1퍼센트 W / V 수산화 칼륨 1.5 ML의 추가와 연관된 이온 십자가를 개시
  2. 진공 건조기에서 복구된 분야를 건조하고 추가 처리없이 분석합니다. 당신은 평균 CSM 입자 크기, 밀리그램 당 표면적 및 입자 크기 분석기를 사용하여 단위 입방 볼륨을 확인할 수 있습니다.
  3. 후속 실험의 경우 잔류 염분을 제거하고 절대적인 에탄올의 5 ML과 하룻밤 세척하여 멸균을 위해 멸균 물을 CSM 세 번 씻는다.

3. 결정CSMs에서의 자유 아미노 그룹의 개수

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

  1. trinitro benzenesulfonic (TNBS) Bubnis 및 Ofner 6 산성 분석을 사용하여 연결하는 이온 간 후 CSMs에있는 무료 아미노 그룹의 개수를 결정합니다. 40 ° C 4 H를위한 50 ML 유리관의 0.5 % TNBS 용액 1 ML과 microspheres의 5 밀리그램을 품어 60시 6N HCL 3 ML의 추가 ° 2 시인데을위한 C와 hydrolyze.
  2. 실내 온도에 샘플을 시원하고 탈이온수 5 ML과 에틸 에테르 10 ML을 추가하여 무료 TNBS 압축을 풉니다.
  3. ° C 물 목욕 15 분 실온에 시원한 잔여 마취제, 증발 및 물 15 ML로 희석하기 위해 40 수성 단계의 5 ML 나누어지는을 따뜻하게.
  4. 빈과 키토산은 CSM P 사용으로 키토산없이 TNBS 솔루션을 사용하여 분광 광도계로 345 nm의 흡광도에서 측정아미노 그룹의 총 수를 결정하는 배상. 키토산에 상대적인 CSM 무료 아미노 그룹의 수를 예상됩니다.

4. CSM의 로딩 ASC

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

  1. 하룻밤 무균 HBSS의 섹션 2.5에서 소독 CSMs의 5 밀리그램을 평형과 8에 추가 - μm의 기공 크기의 멤브레인 문화 플레이트 인서트 (24 잘 플레이트).
  2. CSMs가 막에 정착한 후, 조심스럽게 HBSS를 대기음와 인서트의 외부로 성장 미디어 삽입 700 μL의 내부에 성장 배지 300 μL를 추가합니다.
  3. 문화 플레이트 인서트 내부 CSM 이상 성장 매체와 종자 200 μL의 적절한 농도에서 Resuspend ASCs (1 × 10월 4일부터 4일까지 × 10 4). 문화 삽입 내에서 매체의 최종 부피는 시딩 후, 500 μL입니다.
  4. Incub37 5 % CO 2 humidified 배양기에서 24 H에 대한 CSMs에 ASC 씨앗을 품고 ° C를 먹은

5. CSMs에 ASC로드 및 세포 생존 능력의 비율을 결정

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

  1. 삽입 막으로 마이그레이션한 세포를 방해하지 않고 멸균 1.5 ML microcentrifuge 튜브의 인큐베이션, pipet ASC-로드된 CSM 후에.
  2. 잔여 매체를 제거하고 튜브에 신선한 성장 매체 250 μL를 추가합니다.
  3. 각각의 튜브로 MTT의 25 μL 추가 [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium 브로마이드] 솔루션 (5 밀리그램 / ML)과 2 humidified 5 % CO에서 4 H 위해 품어 37 보육 ° C.
  4. 부화 후, 매체를 제거 디메틸 sulfoxide 250 μL를 추가하고 formazan 복잡한 solubilize 위해 2-5 분 와동 혼합.
  5. 2,700g에서 CSM을 원심 분리기5 분, 뜨는 오프 pipet과 MTT 제조 업체의 사양에 따라 표준 플레이트 판독기를 사용하여 570 nm의 및 630 nm의 파장에서 그 흡광도를 결정한다.
  6. 표준 곡선을 개발 배양해 정의 ASC 번호에서 얻은 값에 상대적 CSMs와 연관된 휴대폰 번호를 확인합니다.

6. ASC-CSM의 준비 및 특성화는 PEG-섬유소의 젤에서 임베디드

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

  1. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 섬유소 (PEG-섬유소) 히드로겔는 Suggs 준비한 7 succinimidyl glutarate 수정된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG; 3400 다)를 분해하여. 트리스 버퍼 염분 (TBS, 산도 7.8) 및 필터 소독 4 ML을 사용하여 방금 실험을 시작하기 전에 0.22-μm의 필터. 용해 PEG가 처음 3-4시간이 응용 프로그램에서만 유효합니다.
  2. 믹스 500 &무, 피브리노겐 재고 없음 L (TBS, pH는 7.8에서 40 밀리그램 / ML)와 37도 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에 20 분 6 잘 판과 부화의 문화 PEG 주식의 250μl ° C. 피브리노겐 :이 혼합물은 1시 10분, sg-PEG-SG의 어금니 농도 비율을 구성합니다.
  3. CSM 5 밀리그램의 농도에서 ASC-CSM 250 μl을 가지고, (≈ 2 × 10 4 세포)와 PEGylated 피브리노겐 용액과 섞는다.
  4. 즉시 트롬빈 주식 (25U/mL) 1 ML을 추가하고 신속하게 피펫으로 한 두 번 씹다. 10 분 완성 겔화 수 있도록하기 위해 37 ° C에서 PEG-피브리노겐과 트롬빈을 혼합 후에는 즉시 12 잘 판에 셀 - 젤 혼합물을 넣고 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에 incubated. 겔화 시간이 빨리이기 때문에, 이상의 5 초 동안 피펫 팁 내에서 겔 용액을 시도하고 지켜 볼수는 없다. PEGylated 섬유소는 트롬빈에 의해 죽습하고 PEGylated 섬유소의 히드로겔를 형성하고 있습니다. 등의, 일전자 최종 겔 제품은 PEG-섬유소로 언급됩니다.
  5. HBSS로 두 번 PEG-섬유소의 젤을 씻어 37에서 5 % CO 2 humidified 배양기에서 10 % FBS와 보충 알파 최소한의 필수적인 매체 (α-MEM) ° C.로 품어
  6. 표준 광 현미경 기술을 이용하여 11 일 동안 젤로 CSM에서 세포의 마이 그 레이션을 관찰.

7. ASC-CSM의 준비 및 특성화는 콜라겐 젤에 임베디드

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

  1. 2N NaOH를 사용하여 6.8로 산도를 조정 후 Bornstein 8 fibrillate의 방법에 따라 쥐의 꼬리 힘줄에서 추출한 제 1 형 콜라겐 (7.5 밀리그램 / ML)의 혼합 비율은 ASC-CSM (5 MG는 ≈ 2 × 10 4 세포를 포함).
  2. 12 잘 판에 fibrillated 콜라겐-ASC-CSM 혼합물을 추가하고 5 %의 CO 2 humidi에서 30 분 동안 품어37 들이었다 인큐베이터 ° C.
  3. 전체 세동 후, 37 ° C.에 최대 5 % CO 2 배양기 humidified 11 일 동안 콜라겐-ASC-CSM의 젤을 품어
  4. 표준 현미경 기술을 이용하여 11 일 동안 젤로 CSM에서 세포의 마이 그 레이션을 관찰.

8. Bilayered PEG-섬유소 - (ASC-CSM) - 콜라겐 젤 구조의 개발

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

  1. 이중층 구조로 개발하려면 약간의 수정으로 위의 설명 콜라겐과 PEG-섬유소의 젤을 모두 준비합니다. 1)로드 ASC : 간단히, 4 단계 프로세스를 사용하여 콜라겐과 PEG-섬유소의 공사장 공중 발판 사이에 '샌드위치'ASC-CSMs 두 bioscaffolds를 사용하여 줄기 세포의 단일 소스의 철새와 공동 유도 속성을 공부할 수 있도록 CSM, 2)에 열 위에 fibrillated 콜라겐 겔과 계층 ASC-CSM 비즈를 던지다lagen 겔, 3) 캐스트 PEG-섬유소의 ASC-CSM-콜라겐 겔 이상 겔과 젤은 응고 수 있도록하고, 4) 잘으로 매체 추가하고 체외에서 세포를 공부하거나 (그림 1 참조 생체내 응용 프로그램에 대한 삽입에서 제거 삽입 ).
  2. 1-ML 타입 혼합물에 ASC-CSM을 추가하지 않고, 7.1에서 위에서 설명한대로 한 콜라겐 (7.5 밀리그램 / ML) 혼합물을 준비합니다. 6 잘 조직 문화 삽입 (8 μm의 기공 크기)에 혼합 배치하고 37 ° C.에 5 % CO 2 humidified 배양기에서 30 분 동안 품어
  3. 문화 미디어 (200 μl)에 정지 ASC-CSM의 콜라겐 표면에 5 밀리그램 (10, 000 세포 / MG)를 완벽하게 세동, 레이어 후에. microspheres가 젤 위에 정착 후, 혼합물에 ASC-CSM을 추가하고, ASC-CSM-콜라겐 층 이상의 층 PEGylated 피브리노겐 / 트롬빈 솔루션을하지 않고, 같은 섹션 6.0에서 설명한 PEG-섬유소 젤을 준비합니다. PEG-섬유소 젤을 비교할 때, T 대신에 세포 배양 배지 250 μl를 사용세포를 포함하는 매체의 그는 250 μl.
  4. 마치고, 배지와 구조를주고 전에 완전한 겔화을 달성하기 위해 5 %의 CO 2 humidified 배양기에서 30 분 구조를 품어.
  5. 전체 겔화 후, 하단 챔버의 구조와 매체 3 ML 이상의 상부 챔버의 매체의 장소 1 ML.

9. 증권 솔루션 만들기

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

  • 염화칼슘 주식 (40 음) :로만 CaCl 2 0.2 H 2 O를 사용하여 탈이온수 100 ML와 CaCl 2 0.2 H 2 O의 588.4 MG를 해산. 0.22-μm의 필터를 사용하여 소독.
  • 폴리에틸렌 글리콜 : PEG가 산소와 반응성이 매우 높은하며 실내 공기에 노출되면 산화 될 수 있습니다. 따라서 PEG는 질소 (N 2) 분위기 아래에 저장해야합니다. ACCurately 사용할 준비까지 -80에서 2-ML 원심 튜브 (사용하기 전에 N 2와 함께 튜브를 정화해야합니다) 및 매장 ° C에서 32 밀리그램의 무게를. 사용하기 전에 TBS 솔루션 4 ML에 PEG 32 MG를 해산.
    다음과 같은 솔루션은 모든 실험을하기 전에 신선한하셔야합니다.
  • TBS 용액 : (25시 산도 7.75-7.77 ° C, 25 ° C에서 산도가 매우 중요합니다.) TBS 용액의 15 ML를 준비하려면, 조심스럽게 필터 소독 탈이온수 한 버퍼 정제를 해산하고 필요한 산도를 조정합니다. 그것이 매번 신선한 솔루션 대비 주식을 보관하지 마십시오.
  • 피브리노겐 솔루션 : (40 밀리그램 / ML). 피브리노겐 농도 40 밀리그램 / ML를 만들기 위해 TBS에서 피브리노겐 가루를 해산. 4에서 자기 활동가를 사용하여 하룻밤을 용해 ° C. 그것은 TBS의 필요한 금액 전체 1-g 수량을 용해하는 것이 더 쉽습니다. 다음 날, 4 ° C (보통 흐림)에서 섬유소를 제거하고 그것을 허용동질적인 솔루션을 얻을 때까지 물 목욕 따뜻합니다. 마지막으로, 0.45-μm의 필터를 사용 피브리노겐 멸균을 필터링합니다.
  • 트롬빈 용액 (25 단위 / ml) 쇼핑 : 트롬빈 솔루션을 만들기 위해 필요한 금액을 무게와 준비된 40 MM CaCl 2 0.2 H 2 O에 함께 녹아 항상 재고를 만들기 위해 트롬빈의 전체 유리병을 사용하는 것이 좋습니다. 예 : -20 ° C. 200 CaCl 2의 MM 0.2 H 2 O, 나누어지는 및 매장 : 5 개 구 트롬빈의 병을 디졸브

10. 대표 결과

여기에 제시된 기법의 전반적인 목표는 배달 차량으로 CSM을 사용하여 여러 phenotypes로 ASC의 동시 행렬 기반의 분화의 가능성을 입증하는 것입니다. 우리는 bilayered 콜라겐-PEG-섬유소 발판으로 CSMs에서 줄기 세포를 전달에서 체외 전략을 보여줍니다. ASC의 특성이 발판 reveale 내에 내장ASC-로드된의 CSMs는 콜라겐 및 PEG-섬유소의 레이어 사이에 "끼워 넣었지"할 수있는 D는 동시에 differentially 새로운 조건 하에서 번창하고 두 세포외 환경으로부터 신호를 받아. 우리가 먼저 세포 생존 능력과 철새 용량을 유지하기위한 모델 시스템의 기능을 특성화. 콜라겐은 그들의 "stemness"등 Stro-1 자신의 표현과 fibroblast와 같은 형태 (그림 2D 및 2 층)에 의해 입증되었습니다 유지를 위해 ASCs의 능력을 지원합니다. 그들의 튜브와 같은 구조 형태, 폰 Willebrand 인자 (그림 2E와 2G) 자신의 내피 세포 특정 표현, 그리고 pericyte 특정 표현에 의해 입증되는대로 반면, PEG-섬유소는 혈관 표현형쪽으로 차별 ASCs을 유도 NG2와 혈소판 - 유도 성장 인자 수용체 베타 (PDGFRβ) (데이터가 표시되지 않음). 또한, 이러한 관찰된 phenotypes 일찍 문화가 발생하는 것으로 나타났다, 11 일 동안 유지되었다로서 민주 공화국이다그림 3과 onstrated.

표 및 그림

이중층의 장점은 건설하세요 :

  • 세포가없는 비계 혼자서 bioactive 발판으로 수행할 수 있습니다.
  • PEG-섬유소는 성장 요인의 추가하지 않고 차별화하는 데 줄기 세포를 유도하실 수 있습니다.
  • 콜라겐은 ASCs의 줄기 세포 표현형을 유지하는 데 도움하실 수 있습니다.
  • 이중층의 구조는 다른 세포 유형의 마이 그 레이션하고 (예, 내피 세포, fibroblast, keratinocytes, 평활근 세포, pericytes) 분아 따위에 의해 번식하는 적극적인 기판으로 사용할 수 있습니다.
  • 그것은 열심히하고 부드러운 조직을 재생하는 hydroxyaptite 또는 demineralized 뼈 같은 하드 조직 공학 공사장 공중 발판으로 사용할 수 있습니다.
  • 이것은 다층 다양한 조직 - 공학 구조를 (등 피부 - 혈관, 혈관 - 상피, 피부 - 혈관 - hypodermal 등) 개발하는 데 사용할 수 있습니다.
  • 그것은 동시에 개발하는 단일 셀 소스를 사용합니다다세포 구획.
  • 그것은 자연의 원산지이기 때문에 호스트 조직으로 통합하는 잠재력을 가지고 있습니다.
  • 겔 구조 내에서 CSM은에서 마이 그 레이션하는 세포를위한 플랫폼을 제공합니다.
  • CSM을 준비하는 데 사용되는 키토산은, 잘 알려진 활성 화학 유인 물질이다.
  • "매트릭스 기반의 줄기 세포 분화"의이 프로토콜에 적용된 전반적인 컨셉은 다른 줄기 세포 유형에 적용될 수 있습니다. 그러나 추가 조사는 매트릭스 구동 분화의 가능성을 결정하기 위해 보증합니다. bilayered 젤 비계는 지속하고 통제된 방법으로 세포를 전달하는 저수지 역할을 할 수 있습니다.
  • 재건축 후, 젤은 여전히​​ 개별 구성 요소로 분리될 수있다.

그림 1
그림 1. 도식은 전반적인 목표와 기법의 과정을 묘사. 1) 지방 파생 줄기 세포 (ASCs)은 싸다입니다키토산 microspheres에 aded. 2) 콜라겐은 다음 6 잘 삽입, 콜라겐 fibrillate하도록 조정 산도, 그리고 6 잘 플레이트 챔버에 배치 삽입에 부어있다. ASC-로드의 CSM의 분야는 다음 콜라겐을 통해 상상을 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있다. 3) PEGylated 피브리노겐 그러면 콜라겐 (ASC-CSM) 위에 부어 및 트롬빈의 추가에 의해 gelled합니다. 4) 최종 이중층의 구조는 다음 문화 삽입에서 제거하고 체외 또는 생체내 분석을 위해 사용될 수 있습니다.

그림 2
ASC의 그림 2. 특성화는 콜라겐 및 PEG-섬유소 차원 매트릭스 내에 배양해. 격리된 ASC의) 위상 대조 현미경은 passaged과 일상 2 차원 세포 배양 기술을 사용하여 유지. Photomicrographs B, D 및 F는 ASC-CSM은 3 차원 콜라겐 겔 내에 배양해 묘사, C, E 및 G 쇼 ASC-CSM 하루에 1부터 3 차원 PEG-섬유소 겔 모두 내에 배양해 반면,2. B와 C)에서 ASCs는 두 비계 종류의 CSM의 영역에서 떨어져 이주 표시됩니다. ASCs는 줄기 세포 마커 Stro-1 (; 화살표 D) 그들의 표현을 유지하면서, 콜라겐 (B)에서 플랫, 스핀들과 같은 형태를 가지고있는 것 같습니다. PEG-섬유소의 ASCs에서 배양해 때하면 더 많은 튜브와 같은 구조를 전시하고 폰 Willebrand 계수 (E)과 같은 혈관 세포 마커를 표현하는 유도하고 있습니다. 전송 전자 현미경은 각 발판 이내 ASCs에서 보여준 전형적인 형태를 묘사. (; 화살표 G) 콜라겐 젤의 ASCs는 ASCs 일반적 lumenal (L 레이블) 구조를 형성하는 반면, 셀 (F)의 몸에서 연장 작은 filopodia (FL)가 보인다.

그림 3
그림 3. 콜라겐의 bilayers 및 PEG-섬유소의 젤 사이 ASC-CSMs의 형태학의 분석. ASC-CSMs는 콜라겐 및 PEG-섬유소의 젤 사이에 "끼워 넣었지"11 일 동안 문화를 유지했다. 왼쪽 coluMN은 이전과 콜라겐 매트릭스 내에서 proliferating ASCs을 묘사하고 스핀들과 같은 형태를 데리고 나타납니다. 오른쪽 열에는 ASCs 멀리 CSMs에서 마이 그 레이션 및 PEG-섬유소 겔 전체에 튜브와 같은 구조를 형성을 묘사.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ASCs은 고립과 다양한 세포 유형으로 차별화할 수있는 능력 자신의 용이성에 대해 잘 알려져 있습니다. 본 원고에서 설명한 기법을 통해, 우리는 동시에 여러 biomatrices 이러한 세포를 노출함으로써 ASCs의 소성을 이용하실 수 있습니다. 세포가 자신의 CSM베이스에서 떨어져 마이 그 레이션과 그 주변의 세포외 환경을 입력할 때, 세포는 비계에서 실수를 타고 중 "stemness"(콜라겐)을 유지하거나 혈관 및 혈관 -지지 세포 유형 (섬유소)를 향해 차별 유도되. 우리 연구소는 피부와 부드러운 조직 상처 치유에 관심이 있기 때문에, 우리는 전략적으로 섬유소가 자연스럽게 혈관 네트워크를 형성 9 유도 반면 콜라겐은 호스트에 의해 피부 및 표피의 재생을 지원하기 때문에 콜라겐과 섬유소의 이중층을 구현. 또한, 그것은 이제 크로스 이야기가 피부 keratinocytes, fibroblast, 그리고 근본적인 혈관 네트워크를 proliferating 사이에서 발생하는 이해하며,이 복잡한메커니즘은 적절한 상처 치료 10 매우 중요합니다. 기본적인 혈관 네트워크가 없으면 조직 - 엔지니어링 피부 이식은 어려움 호스트 조직과 inosculating 있습니다. 따라서 우리의 전반적인 가설은 콜라겐과 ASCs와 함께 이중층으로 사용 섬유소가, 혈관, 피부, 그리고 다시 epithelialization 프로세스 하나 이상의 단계를 개선하여 상처 치유 시간을 줄일 것입니다.

섬유소는 monomeric 피브리노겐에서 파생된 fibrinopeptide의 트롬빈 - 중재 절단 후 형성된 다양한 생체 고분자이다. 섬유소는 hemostatic 에이전트 (미국 식품 의약품 행정의 승인)로 등 부드러운 조직 절개와 같은 절차를 포함하여 임상 응용 프로그램의 다양한 밀봉 재로서 임상적으로 사용되었습니다. 상업적으로 정화 allogeneic 피브리노겐 및 트롬빈에서 섬유소의 hydrogels는 조직 공학적 응용 프로그램의 다양한 지난 10에서 널리 사용되었습니다. 그러나 일부 주요 단점 전N 섬유소의 히드로겔를 사용하면 조직 - 엔지니어링 구조의 적절한 형성하기 전에), 낮은 기계적 강성, 그리고 3) 급속한 저하를 2 축소하기위한 발판 1) 가능성이 될 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 섬유소는 사용이 더 입체 조직 - 엔지니어링 발판으로 임명되기 전에 수정해야합니다. 하나는 이러한 접근 방식은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-섬유소)와 섬유소를 copolymerizing있다. 우리의 예비 작업은 수정되지 않은 섬유소 등 다른 히드로겔 드레싱, 위에 상처 치유에 그것이 유리하게 PEG-섬유소의 여러 독특한 기능을 시연했다. PEGylated - 섬유소는 합성 hydrogels와 천연 재료를 모두 고유의 기능을 전시하고 있습니다. 특히, PEG의 존재는 exudates을 관리하기위한 고도 충분한지 (> 90 % 물) 습한 환경을 제공합니다. 둘째, 섬유소의 존재는 자료 biodegradability을 수여하지만, 사전 결과가 PEGylated 섬유소가 unPEGylated 섬유소보다 체외에서 훨씬 더 안정적인 것을 보여주

우리 이중층의 두 번째 구성 요소는 콜라겐입니다. 콜라겐은 자연 biomaterial ubiquitously 포유류로 표현하고 세포의 다양한 유형의 첨부 파일의 직접 사이트의 역할이다. 다른 조직은 조직의 기능적 필요성의 종류에 따라 콜라겐의 다른 유형 (타입 1-type29)를 표현. )는 매우 다공성 히드로겔, 4는 우리의 모델은 매우 매력적인 만드는 콜라겐의 다른 고유한 특성)이 그 하나입니다 그것이, 2 비 염증성입니다) 콜라겐 둘 다 전체와 타락한 구성 요소), 3 biocompatible 있습니다 그것은 세포 침투를 지원합니다 및 마이 그 레이션, 5) 그것은 modulating 배합에 의해 조정할 수 있으며, 7) 그것은 쉽게 호스트 조직으로 inosculates 줄기 세포, 6)의 multipotency 유지합니다. 피부와 부드러운 조직 재생에 우리의 연구 내용은 콜라겐으로 구성된 이중층 종합 지수는 이후 자연 선택이다그것은 매우 깊은 피부 영역을 포함한 피부 전체에 표현되고, 상처의 깊이를 평가하는 immunohistochemistry 마커로 사용될 수 있습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 다양한 혈관 세포 유형으로 ASCs을 차별하면서 동시에 ASCs의 "stemness"을 유지하는 기법을 보여줍니다. 피부와 그 기본 부드러운 조직의 연구 내용은 콜라겐과 PEG-섬유소 직접 적용할 수 있습니다. 그러나 다른 bioscaffold 자료는 다른 세포 유형으로 ASC를 유도하기 위해 탐험의 특수한 능력을 연구하기 위해 구현할 수 있습니다. 여기에 구현된 기술은 줄기 세포 phenotypes을 제어에서 세포외 기질의 중요성을 강조하는 데 도움과 피부 재생을위한 계층화된 복합 재료의 탐사에 신빙성 것으로.

개요

중요 단계

  • 콜라겐은 섬유성 연축을 유발하고 안정적​​인 겔 하위 버전을 위해 올바른 isoelectric 산도 (pH6.8-7.1)로 조정한다ucture.
  • PEG는 수성 PEG의 수명은 (4-5시간) 짧은이기 때문에 피브리노겐 용액과 혼합하기 전에 신선하게 준비되어야한다.
  • 피브리노겐-PEG 혼합물의 인큐베이션 시대는 이제 끝났다 - 부화가 겔화되는 동안 짙은 불투명 침전을 일으킬 수 있으므로 25 분 (° C 37) 넘지 않아야합니다.
  • PEGylated 피브리노겐 용액에 트롬빈를 추가한 후, 혼합물은 즉시 문화 삽입 (피펫과 부드러운 혼합 후)에 적절하게 사용해야합니다. 긴 시간 (> 30 초)에 피펫 팁에 솔루션 혼합물을 개최하는 것은 피펫 팁 및 고르게 부어 젤을 얻기 어려움 이내 겔화의 원인이 될 수 있습니다.
  • CSM 침대 위에 microspheres 균일 크기와 균일하게 분포돼 세포를 사용하면 최적의 셀 로딩에 중요합니다. 지름 CSM 크기 편차 직접 고르게 분산된 반면, ASC-CSM 직접 t으로 셀 마이 그 레이션에 영향을 미칩니다, microspheres의 밀리그램 당 세포 부착에 사용할 수 표면적 영향을 미친다그는 공사장 공중 발판. 셀 - 로드된 microspheres (ASC-CSM)는 비계 이내 ASCs의도 마이 그 레이션을 보장하기 위해 콜라겐 젤 위에 균일하게 분산되어야합니다. ASC-CSMs의 분포가 너무 조밀한 경우 세포 이주는 젤 내의 특정 지역에 집중받을 것이며, 세포 - 세포 상호 작용 이후의 마이 그 레이션을 제한할 수 있습니다.
  • 미디어의 볼륨이 세포 배양 삽입의 바깥 잘 추가되었는지 확인하는 것이 아니라 내부의 초승달 모양보다 높은 것입니다. 일반적으로 내부 : 이것은 세포가 microspheres에 부착 용이으로 1시 2분의 외부 볼륨 비율이 적합합니다.

제한 사항

  • 이 방법은 microspheres에서 사용 가능한 총 표면적으로 제한됩니다. 높은 휴대폰 번호가 필요한 경우 더 microspheres는 표면적을 증가해야합니다.
  • 세포가 microspheres에서 마이 그 레이션하기위한되므로 시간 지연이에와 젤류 내에서 세포의 초기 마이 그 레이션에 대한 관찰 수 있습니다.
  • microspheres 두 젤류의 인터페이스 (콜라겐 및 PEG-섬유소)에 있으며, 이것은 젤의 말초 엔드에 세포의 마이 그 레이션을 위해 긴 시간을 제한할 / 걸릴 수 있습니다.
  • 이중층의 건설 동안 PEGylated 피브리노겐-트롬빈 혼합물은 콜라겐 위에 CSM-ASC 침대를 통해 신속하게 추가되어야합니다. 이것은 ASC-CSMs의 재 배포 고르지 않을 수 있습니다. PEG-섬유소 겔 캐스팅 중에 인터페이스에서 ASC-CSMs의 고르지 재 배포하는 경우에는 겔 구조가 서서히 빠르게 재배포 microspheres를로 수동 교반 수 있습니다 완전한 겔화 전에.
  • 이 방법은 철새 특성을 가지고 있으며 정박지 독립적인 세포 유형을 전달하기 위해 적합되지 않을 수도 셀로 제한됩니다.
  • 세동 전에 콜라겐 솔루션은 산성 산도에 남아 콜라겐 젤 내에서 세포의 직접 혼합을 제한합니다. 합리적인 기간 (~ 30 분) 이내에 조정하지 않으면 따라서, 세포 생존 문제가 생길 수 있습니다.
  • g부터이 구조에서 사용되는 ELS는 개별적으로 젤의 가능한 장애 또는 분리 프로세스를 처리하는 동안 발생할 수있는, 상상을 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있다. 따라서 그것은 생체내 연구에 중 취급 용이성을 제한할 수 있습니다.

가능한 수정

  • ASC-CSMs는 개별 젤 대신 layering들을 인터페이스에서 내에서 균등하게 배포할 수 있습니다.
  • ASCs 개별 젤류 이내에 오히려 CSM에 의해 전달보다 직접 혼합이 될 수 있지만, 이것이 조직화되고 셀 패턴 조직 구조의 개발을 제한할 수 있습니다.
  • PEG-섬유소 주조 동안 ASC-CSMs의 고르지 다시 유통을 방지하려면 ASC-CSMs는 수성 키토산 용액의 소량 (1 % W / V)에 정지하고 콜라겐 젤 위에 균등하게 배포할 수 있습니다. 이것은 콜라겐 겔 층 이상의 ASC-CSMs의 확고한 첨부 파일을 보장하며 콜라겐 표면에서 ASC-CSMs의 dislodging 방지할 수 있습니다.
  • 자체적으로 구조는 간접적인 방식으로 활용할 수 있으며, 즉, PEG-Fibrin에 젤 먼저 캐스팅 수 있으며 ASC-CSMs는 콜라겐 젤 뒤에 PEG-섬유소의 젤 위에 씨앗이 될 수 있습니다. 이렇게하면 사용자가 PEG-섬유소의 젤 달리 fibrillated 콜라겐 솔루션은 고체화하기 위해 추가 시간 (30 분)이 필요합니다, 이후 더 조심스럽게 (ASC-CSM)-PEG-섬유소 계층을 통해 fibrillated 콜라겐 솔루션을 캐스팅 할 수 있습니다. 이 과정을 채택하여 하나 ASC-CSM의 균등을 유지하도록 보장할 수 있습니다.
  • 젤 (콜라겐 및 / 또는 PEG-섬유소의 젤)이 빠른 세포 마이 그 레이션 및 확산을 유도하는만큼, 성장 요인과 같은 mitogens, (예, 혈관 내피 성장 인자, fibroblast의 성장 요인)에 포​​함될 수 있습니다.

문제 해결

  • 산도>는 7.2 isoelectric 산도를 초과하면 콜라겐 솔루션의 세동 동안, 산도는 약한 산성 용액을 사용하여 산도를 낮출보다 콜라겐 주식 솔루션을 추가하거나하여 재조정해야합니다.
  • CSM을 비교할 때, 만약 크기 occu에 큰 변화그리고 RS, 매개 변수의 수를 원하는 CSM 크기를 (키토산 주식 솔루션의 점도, 계면 활성제의 볼륨, 교반 속도 등)을 양보하도록 조정할 수 있습니다.
  • 젤을 채우지 느린 세포 마이 그 레이션의 경우, ASC-CSMs의 높은 숫자가 젤로 CSM 밖으로 마이 그 레이션하는 세포의 수를 증폭하는 데 사용할 수 있습니다.
  • PEG-피브리노겐 겔화 과정은 혼합물 (일반적으로 900 μL 대신 1 ML)에 추가 트롬빈의 볼륨을 절단하거나 트롬빈의 낮은 농도 주식 (25 U / ML 대신 20 U / ML)를 준비하여 저능아가 될 수 . 이것은 PEG-피브리노겐 혼합물의 느린 겔화을 허용하고 따라서 ASC-CSMs 이상 PEGylated-피브리노겐 및 트롬빈 혼합물의 신중한 캐스팅을 위해 추가 시간을 제공합니다.
  • 상 분리가 발생하는 경우 배양 기간 동안 (콜라겐과 섬유소 젤 사이), 멸균 테플론 'O'링은 겔 단계의 체결 있도록 상위 구조에 둘 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

어떤 경쟁하는 금융 이익은 존재하지.

유의 사항

여기에 포함된 의견이나 주장은 저자의 개인 의견이며 공식이나 국방 또는 미국 정부 부서의 의견을 반영 해석할 수 없습니다. 저자는 미국 정부의 직원이며,이 작품들은 공무의 일환으로 준비되었다. 모든 작품은 미국 육군 의학 연구 및 Materiel 명령에 의해 지원되었다. 이 연구는 미국 육군 의학 연구 및 Materiel 명령 기관 심사위원회 및 승인 절차에 따라 검토와 승인 절차하에 실시되었다.

Acknowledgments

SN은 피츠버그 조직 공학 이니셔티브에서 박사 과정 이수 화목 그랜트에 의해 지원되었다. DOZ는 제네바 재단에서 수여 교부금에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
  2. Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
  3. Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
  4. Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. (2008).
  5. Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
  6. Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
  7. Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
  8. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
  9. Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
  10. Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
  11. Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter