Summary
In questo articolo, un metodo ad alta velocità viene presentato per la sintesi di oligosaccaridi e fissaggio alla superficie delle nanoparticelle polianidride per ulteriore uso in mira specifici recettori sulle cellule presentanti l'antigene.
Abstract
Approcci multidisciplinari che coinvolgono settori come la progettazione di materiale, le nanotecnologie, la chimica, immunologia e devono essere utilizzate per progettare razionalmente efficaci vettori vaccini. Nanoparticelle basate su piattaforme può prolungare la persistenza di antigeni del vaccino, che potrebbero migliorare vaccino immunogenicità 1. Vari polimeri biodegradabili sono stati studiati come veicoli di mandata del vaccino 1, in particolare, polianidride particelle hanno dimostrato la capacità di fornire il rilascio prolungato di antigeni proteici stabili e di attivare le cellule presentanti l'antigene e modulare le risposte immunitarie 2-12.
Il disegno molecolare di questi vettori vaccinali deve integrare la selezione razionale delle proprietà dei polimeri così come l'inserimento di opportuni agenti di targeting. Fabbricazione elevato throughput automatizzato di mira leganti e particelle funzionalizzate è un potente strumento che migliorerà la capacità di studiare una gamma range di proprietà e porterà alla progettazione di dispositivi riproducibili somministrazione del vaccino.
L'aggiunta di mira ligandi in grado di essere riconosciuto da specifici recettori sulle cellule immunitarie è stato dimostrato per modulare e adattare le risposte immunitarie di tipo C 10,11,13 recettori lectina (CLR) sono recettori di riconoscimento di pattern (PRRS) che riconoscono carboidrati presenti sul superficie di agenti patogeni. La stimolazione di cellule immunitarie attraverso CLR consente di internalizzazione maggiore di antigene e successiva esposizione per ulteriore attivazione delle cellule T 14,15. Pertanto, molecole di carboidrati svolgono un ruolo importante nello studio di risposte immunitarie, tuttavia, l'uso di queste biomolecole soffre spesso dalla mancanza di disponibilità di strutturalmente ben definiti e carboidrati puri. Una piattaforma di automazione basato sulla soluzione iterativa fase reazioni possono consentire rapida sintesi e controllato di queste molecole sinteticamente impegnativi utilizzando b significativamente più bassoOSTRUIRE quantità di blocchi rispetto ai tradizionali metodi in fase solida 16,17.
Qui riportiamo un protocollo per la soluzione automatizzata di sintesi in fase di oligosaccaridi come ligandi destinate mannosio-based con fluorous estrazione in fase solida per la purificazione intermedia. Dopo lo sviluppo di metodi automatici per rendere la base di carboidrati agente di targeting, si descrivono metodi per il loro fissaggio sulla superficie di polianidride nanoparticelle impiegando un set up robotizzato azionato da LabVIEW come descritto in precedenza 10. Funzionalizzazione superficiale con carboidrati ha dimostrato l'efficacia in termini di orientamento CLR 10,11 e aumentare il throughput del metodo di fabbricazione per portare alla luce le complessità associate a un sistema multi-parametrico sarà di grande valore (Figura 1a).
Protocol
1. High-throughput carboidrati Sintesi
- Prima della sintesi automatizzata di dimannoside, un donatore di zucchero opportunamente protetta, tipicamente tricloroacetimmidato, e accettore, principalmente un alcool alchenile fluorous, sono sintetizzati in banco.
- Un programma è stato scritto per la sintesi automatica di dimannoside. Una rappresentazione schematica della procedura automatizzata di base è presentata in Figura 2. Nel programma, è garantito che prima dell'aggiunta del promotore, la miscela di donatore e accettore viene agitata per almeno 30 min.
- Soluzioni del donatore sintetico, accettore e trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate sono realizzati in diclorometano. Toluene e diclorometano sono usati più frequentemente per le reazioni di glicosilazione.
- Inoltre, preparare soluzioni di reagenti per la deprotezione di gruppi di protezione temporaneo in 80% metanolo e 100% di metanolo.
- Prima dell'inizio del programma, in modo che il relaive di umidità nella stanza è del 30% o inferiore nella camera di automazione. Alto tasso di umidità è dannoso per le reazioni di glicosilazione.
- Quando il programma viene avviato, il braccio robotico trasferisce le soluzioni di donatore e accettore nella fiala di reazione sequenziale. Quindi la miscela viene agitata per 30 min.
- Poi il braccio robotico trasferisce 0,2 e 0,3 equivalenti di trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate nella miscela, tipicamente a temperatura ambiente sebbene basse temperature come -20 ° C può essere raggiunto. La miscela di reazione viene agitata per 30 min.
- Dopo 30 minuti, la reazione viene fermata e una piccola aliquota rimosso per monitorare il progresso della reazione. Se non è completa, la reazione può essere continuata e infine il tempo richiesto può essere modificato.
- Una volta che la reazione è completa, la miscela di reazione viene trasferita alle fluorous estrazione in fase solida (FSPE) cartucce contenenti C 8 F 17-modificato gel di silice per la purificazione.
- Il carrellocreste vengono prima lavati con un 80% miscela metanolo-acqua (8 mL) per eliminare la frazione non fluorous.
- Poi le cartucce vengono lavate con 100% metanolo per ottenere il prodotto desiderato fluorous-etichettato. Se si desidera ulteriore purificazione, la macchina può essere interrotta e il prodotto di reazione (s) rimosso per la purificazione mediante ulteriore.
- Dopo il ciclo di depurazione, il braccio robotico dispensa metilato di sodio nel flaconcino di reazione. La reazione viene agitata per 2 h. Se non è completa, la reazione può nuovamente essere continuata per un periodo più lungo e infine il tempo programmato richiesto può essere modificato.
- Dopo il completamento della reazione, il prodotto viene purificato mediante FSPE e quindi sottoposta a dissoluzione in toluene anidro seguita da evaporazione per rimuovere l'acqua residua.
- Quindi il ciclo (da passaggio 6 a 13) si ripete fino alla lunghezza di catena desiderata è ottenuta per la molecola bersaglio.
- Il prodotto ottenuto dalla protetto automazione °en ulteriormente purificati e interamente caratterizzati mediante tecniche come la risonanza magnetica nucleare (NMR). Deprotezione completa (rimozione di tutti i restanti gruppi di protezione) della molecola bersaglio finale viene poi completato all'esterno della piattaforma di automazione di regola perché comporta di solito idrogeno esplosivo e palladio. La fase di deprotezione finale è stata effettuata su banco di fuori della piattaforma di automazione. Il primo passo è stato ozonolisi del doppio legame in tag fluorous seguita da ossidazione dell'aldeide prodotto di un acido carbossilico. Il prodotto è stato purificato mediante cromatografia su colonna. La fase finale era deprotezione di gruppi eterei benzilici da palladio-catalizzata idrogenazione. Il prodotto è stato fatto passare attraverso celite pad per sbarazzarsi di palladio per ottenere puro prodotto finale.
2. High-throughput nanoparticelle funzionalizzazione di superfici
- High-throughput sintesi del polimero e la fabbricazione di nanoparticelle viene effettuata seguendo lo stesso protocol e robotica istituito descritto da Petersen et al 19. I sistemi copolimero utilizzato per la fabbricazione di particelle sono a base di acido sebacico (SA) e 1,6-bis (para-carbossifenossi) esano (CPH), e 1,8-bis ( para-carbossifenossi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) e CPH. Una rappresentazione schematica dell'apparato di deposizione robotico utilizzati è presentato in figura 1b.
- A seguito di fabbricazione di nanoparticelle, il titolare contenere i tubi con la libreria nanoparticelle viene riattaccata alla fase di attuatore lineare.
- Per il fissaggio di carboidrati alla superficie delle particelle polianidride, una ammina-acido carbossilico reazione di accoppiamento 20 costituito da due reazioni consecutive viene eseguita.
- Per la prima reazione, la siringa nella prima pompa programmabile siringa è riempita con 10 equivalenti (eq.) (equivalenti di media concentrazione molare di acido carbossilico sulla superficie delle particelle) di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)-carbodiimide cloridrato (EDC) e 10 eq. di etilendiammina in una soluzione acquosa, mentre la siringa nella seconda pompa siringa programmabile viene caricato con 12 eq. di N-idrossisuccinimmide (NHS) in soluzione acquosa.
- Utilizzando il programma LabVIEW, sospensioni reagenti sono depositati nella biblioteca * nanoparticelle.
- Successivamente, ciascun campione viene sonicata (30 s a 40 Hz) e il supporto tubo è staccato dalla piattaforma robotica.
- Sospensioni di nanoparticelle sono incubate per 9 h ** con rotazione costante a 4 ° C.
- Dopo il tempo di reazione è completata, i tubi vengono centrifugati (12000 xg per 5 min) e ritorno alla stazione robotizzata di effettuare due fasi di lavaggio.
- Per il lavaggio, una siringa rimane vuoto e caricati nella prima pompa siringa programmabile mentre la siringa nella pompa seconda siringa è riempita con acqua fredda. Il sovranatante in ciascun tubo è ritirato nella siringa vuota ed i depositi della pompa secondo acqua fredda.
- Omogeneizzazione del nanosospensione di particelle viene eseguita come descritto nel passaggio 2,6. I tubi sono poi centrifugato (12000 xg per 5 min) e una seconda fase di lavaggio viene eseguita come descritto nel passaggio 2,9.
- Per la seconda reazione, due fasi di deposizione vengono utilizzati. Nella fase di prima deposizione, 12 eq. di EDC vengono caricati con una pompa e 12 eq. di NHS sono caricati con la seconda pompa.
- La fase di deposizione secondo comprende 10 eq. di un saccaride specifico sulle pompe prima e seconda (cioè, galattosio, lattosio o di-mannosio) *** ed una terza pompa con 10 eq. di acido glicolico (usato come controllo ****).
- Sospensioni di nanoparticelle viene omogeneizzata come descritto a passo 2,6 e incubate per 9 h con rotazione costante a 4 ° C.
- Dopo il tempo di reazione è completa, una fase di lavaggio viene eseguita come descritto in fasi 2.8, 2.9 e 2.10.
- La libreria nanoparticelle funzionalizzato viene quindi posto in una camera a vuoto asciugare per almeno 2 ore.
- Le nanoparticelle funzionalizzate sono quindi carattereized raggi X spettroscopia di fotoelettroni e un elevato rendimento fenolo-acido solforico saggio per determinare la composizione di superficie e la concentrazione del saccaride rispettivamente. Microscopia elettronica a scansione e dinamico dispersione della luce vengono utilizzati per determinare la dimensione delle particelle, la distribuzione delle dimensioni, e la carica superficiale.
Note: * I volumi di deposizione variano con la massa di nanoparticelle contenute in ciascun tubo.
I tempi di reazione ** per reazioni prima e seconda può essere modificato per regolare la concentrazione finale saccaride.
*** Ogni saccaride viene depositato in provette a seconda del gruppo desiderato.
**** Per la reazione specifico impiegato in questo studio per il fissaggio di carboidrati, acido glicolico viene utilizzato come controllo linker dal saccaridi deprotetti già questa molecola legata covalentemente, che consente di fissaggio ulteriore superficie delle nanoparticelle.
3. Risultati rappresentativi
Il fuldimannoside ly protetto illustrato nella figura 2 è stato sintetizzato utilizzando la piattaforma di automazione. Il composto sintetizzato è stata caratterizzata da 1 H NMR in uno spettrometro VXR 400 MHz usando CDCl 3 come solvente. Lo spettro NMR è mostrato in Figura 3.
Utilizzando l'elevata produttività fabbricazione nanoparticelle e funzionalizzazione di polianidride nanoparticelle qui descritto, attaccamento di dimannose, lattosio e galattosio è stata effettuata con successo 10, 11. Usando questa configurazione, condizioni di reazione ottimali (cioè, temperatura di reazione e il tempo) sono stati identificati per ottenere nanoparticelle funzionalizzazione desiderata e morfologia. Quando la reazione è stata condotta a 4 ° C invece di temperatura ambiente, una riduzione aggregazione delle nanoparticelle è stato osservato mediante SEM (dati non mostrati). La tabella 1 mostra i risultati rappresentativi della caratterizzazione di funzionalizzato CPTEG 50:50: nanoparticelle CPH sia con di-mannosio olattosio, sintetizzato a 4 ° C. I dati indicano un piccolo aumento del diametro medio delle nanoparticelle per la funzionalizzazione. Mentre i non funzionalizzati nanoparticelle aveva un potenziale negativo zeta di ca. -20 MV, le particelle funzionalizzate mostrato un valore positivo potenziale zeta, dimostrando funzionalizzazione successo della superficie delle nanoparticelle. Lattosio e di-mannosio sono entrambi zuccheri neutri, tuttavia, i gruppi amminici liberi dal etilendiammina linker utilizzato per fissare i saccaridi può essere responsabile della potenziale positivo zeta.
Il tempo di reazione è un'altra variabile che potrebbe influire sia la morfologia finale delle nanoparticelle e il grado di attaccamento zucchero raggiunto. Regolando il tempo di reazione, la concentrazione finale di zucchero attaccato alla superficie nanoparticelle può essere controllato come mostrato nella Figura 4A. Come previsto, la concentrazione di dimannose sulla superficie di 50:50 CPTEG: CPH nanoparticelle aumentatoil tempo totale di reazione e raggiunsero un massimo dopo 18 ore. Nanoparticelle funzionalizzate con il tempo di 24 ore di reazione totale sono stati utilizzati per valutare la loro capacità di indirizzare CLR sul mouse cellule di midollo osseo derivate dendritiche (DC). Citometria di flusso è stato usato per valutare l'espressione di due recettori CL (cioè, CIRE (CD209, DC-SIGN) e recettore del mannosio (CD206)) dopo stimolazione con non-funzionalizzato, e lattosio e nanoparticelle funzionalizzate di-mannosio (Figura 4B). Una più alta espressione di entrambi i recettori, che è un indicativo di un orientamento efficace, è stato ottenuto quando le cellule sono state stimolate con sia lattosio e nanoparticelle funzionalizzate di-mannosio. Tuttavia, di-mannosio-funzionalizzati particelle mostrato un alto livello di espressione indica una specificità di questo ligando per i recettori che sono stati studiati.
| Tipo di nanoparticelle | Diametro particellare medio (nm) | Averabbia particelle ζ-potenziale (mV) |
| Non-funzionalizzato | 162 ± 43 | -20 ± 0,6 |
| Lattosio | 235 ± 34 | 26 ± 2,4 |
| Di-mannosio | 243 ± 32 | 30 ± 4,2 |
Tabella 1. Caratterizzazione delle nanoparticelle. Non-funzionalizzato e funzionalizzati sono stati caratterizzati da quasi elastico light scattering e misurazioni potenziale zeta. Dimensioni delle particelle dati rappresentano la media ± valore di deviazione standard (SD) di dati dinamici diffusione di luce raccolti in tre esperimenti indipendenti. Dati potenziale zeta rappresentano la media ± SD valore di tre letture indipendenti. Cambiare nel segno del potenziale zeta dimostra che lo zucchero era efficiente, coniugato con l'50:50 CPTEG: CPH superficie delle nanoparticelle.
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Figura 1. (A) Rappresentazione grafica della approccio seguito con funzionalizzazione carboidrati di nanoparticelle polianidride e un esempio delle librerie nanoparticelle funzionalizzate che possono essere progettati con l'descritto ad elevata capacità approccio. (B) Rappresentazione schematica dell'apparato di deposizione automatizzata utilizzata per funzionalizzazione particelle, che consiste di (i) tre NE 1000 pompe, (ii) una fase robotico integrato da due attuatori (Zaber): uno per il movimento nella direzione x e l'altra per il movimento nella direzione y, (iii) una seconda fase robotico con due cremagliere adiacenti (appropriata per tubi e le cuvette) costituito da tre attuatori, uno per ciascuna direzione (x, y, z). Le pompe e un totale di cinque attuatori sono collegati in serie. Attuatori e le pompe sono gestiti da un computer utilizzando il software LabVIEW. Questo schema non è in scala.arge.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. Rappresentazione grafica della automatizzato iterativo sintesi di carboidrati usando mannosio come esempio.
Figura 3. 1 H NMR del dimannoside protetto.
Figura 4. (A) Effetto del tempo di reazione sulla concentrazione superficie delle nanoparticelle di saccaride. Nei dati riportati, 50:50 CPTEG: nanoparticelle CPH stati funzionalizzati con dimannose a differenti tempi di reazione e la reazione è stata condotta a 4 ° C. L'errore medio e standard di due esperimenti indipendenti funzionalizzazione viene mostrato. (B) nanoparticelle Lattosio e di-mannosio funzionalizzatiefficace recettore bersaglio DC-SIGN (CIRE, CD209) e mannosio (CD206) su midollo osseo cellule dendritiche, come dimostrato dalla espressione di questi due marcatori dopo stimolazione con funzionalizzato CPTEG 50:50: nanoparticelle CPH se confrontato con l'espressione ottenuta con i non-funzionalizzate particelle.
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Discussion
L'efficacia di carboidrati come agenti per il targeting nanoparticelle interazioni dirette alle cellule immunitarie è stato precedentemente dimostrato 10, 11. Precedente ricerca nei nostri laboratori hanno mostrato che gli zuccheri specifici collegati polianidride nanoparticelle sono in grado di indirizzare CLR differenti sulle cellule presentanti l'antigene (APC), migliorando così l'attivazione di cellule immunitarie che può essere importante per l'ulteriore attivazione delle cellule T 10, 11. Tuttavia, per ottenere il targeting ottimale dei parametri diversi, come ad esempio la chimica polianidride, dimensione, tipo di zucchero di zucchero o di densità di superficie devono essere ottimizzati e quindi aumentare il throughput nel metodo di fabbricazione per portare alla luce le complessità associate con un tale sistema di multi-parametrica sarà di grande valore. Inoltre, l'uso di nanoparticelle funzionalizzate se di grande valore per altri settori correlati di ricerca, tra cui biosensori, l'immobilizzazione degli enzimi, e l'individuazione di foodborne agenti patogeni.
Utilizzando il descritto high-throughput sintesi dei carboidrati, le sfide nella sintesi di molecole di carboidrati riproducibile può essere mitigato. Automatizzati reazioni parallele dello stesso zucchero può produrre grandi quantità di materiale come necessario. I ruoli noti di zuccheri e glicoconiugati sono in rapida espansione. Tuttavia, la comprensione dei meccanismi molecolari di carboidrati in molti processi, come ad esempio vie di trasduzione del segnale, o da processi di riconoscimento cellulari 21, si basa sulla facile reperibilità ed economico strutturalmente ben definite saccaridi. Protezione / deprotezione strategie per controllare la reattività dei diversi gruppi ossidrilici per estensione precisa catena sono un requisito principale per sintesi degli zuccheri, ma sono noioso e che richiede tempo. Oligonucleotidi e oligopeptidi sono regolarmente ed efficiente sintetizzati usando sintetizzatori automatici 22, 23. Un sintetizzatore fase solida è ava ilable per la sintesi di oligosaccaridi 24, ma soffre di alcuni seri inconvenienti: ad esempio, grandi eccessi di blocchi (da 5 a 20 equivalenti per accoppiamento fase), la mancanza di controllo di facile progresso di reazione, e la variabilità intrinseca della fase solida resine impiegate . Una nuova soluzione fase piattaforma di automazione, tuttavia, richiede solo 2 o 3 equivalenti di questi preziosi componenti. In questa piattaforma una varietà di etichette fluorous, come il gruppo alchenile fluorous, consente fluorous estrazione in fase solida (FSPE) per purificare i prodotti intermedi facilmente da non fluorous composti 18, 25, 26. Tuttavia, come mostrato qui, queste etichette non ostano alla soluzione fase di glicosilazione e reazioni deprotezione a standard di solventi organici. Inoltre, a differenza di qualsiasi fase solida sintetizzatore automatico, questa nuova piattaforma consente strategie di reazione standard di monitoraggio, quali la spettrometria di massa (MS) e cromatografia su strato sottile (TLC) in qualsiasi momento.
ONTENUTO "> Come descritto nella sezione dei risultati, in seguito alla elevata velocità funzionalizzazione di nanoparticelle qui presentate, condizioni di reazione (ad esempio, tempo di reazione e temperatura) per ottenere ottimale morfologia nanoparticelle dopo funzionalizzazione sono state ottimizzate. temperatura di reazione ottimale può essere necessario ottimizzare a seconda delle proprietà dei polimeri utilizzati per fabbricare le nanoparticelle (ad esempio, temperatura di transizione vetrosa (Tg), velocità di degradazione). Ad esempio, quando si utilizzano polimeri con bassa T g (sotto della temperatura ambiente), le reazioni di funzionalizzazione dovranno effettuata basse temperature, che è il caso per alcuni dei polianidride chimiche utilizzate nel nostro gruppo di ricerca. ottimizzazione del tempo di reazione totale impiegato per funzionalizzazione particella è desiderata soprattutto quando la chimica di particelle con differenti velocità di degradazione devono essere funzionalizzata. più breve tempo di reazione può essere ideale per funzionalizzare bulk-erosione e materialispecialmente quando uno zucchero destinazione deve essere legato a particelle farmaco-proteina o-caricati. Concentrazione di zucchero sulla superficie delle particelle può essere una variabile importante per dirigere le prestazioni biologico di questi vettori. Il risultato biologico di diversa concentrazione zuccherina è una attuale area di studio nei nostri laboratori. L'utilizzo di questo throughput elevato impostato per fabbricare e nanoparticelle polianidride funzionalizzati consente per la prova di più variabili più veloce e metodi di fabbricazione convenzionali funzionalizzazione. La limitazione principale della tecnica velocità elevata è la grandezza del lotto massima di particelle che può essere ottenuta poiché è limitata dalla dimensione dei contenitori che possono essere contenuti nei supporti apparecchi: tuttavia, in quanto l'uso principale di questo set up è per lo screening lotto dimensioni inferiori possono essere efficientemente utilizzare per questo scopo.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NLBP è cofondatore e detiene partecipazioni in società carboidrati LuCella Biosciences, Inc.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare l'US Army Medical Research e Materiel Command (Grant # W81XWH-10-1-0806) e il National Institutes of Health (Grant # AI091031 U19-01 e Grant # 1R01GM090280) per il sostegno finanziario. BN riconosce la cattedra Balloun in Ingegneria chimica e biologica e NLBP riconosce la cattedra di Ingegneria Interdisciplinare Wilkinson. Ringraziamo Julia Vela per la sua assistenza nello svolgimento degli esperimenti funzionalizzazione delle nanoparticelle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| ASW 1000 | Chemspeed Technologies | ||
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| XL-2000 Sonicator | Qsonica | Q55 | |
| Mini-tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 |
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