Summary
この記事では、ハイスループット法は、抗原提示細胞上の特定の受容体を標的のさらなる使用のための無水物ナノ粒子の表面に糖鎖とその添付ファイルの合成のために提示されます。
Abstract
そのような材料設計、ナノテクノロジー、化学、免疫学などの分野を含む学際的なアプローチが合理的に有効なワクチンキャリアを設計するために使用する必要があります。ナノ粒子ベースのプラットフォームでは、ワクチンの免疫原性1を向上させることがワクチン抗原の持続性を延長することができます。いくつかの生分解性ポリマーは、ワクチンの送達媒体1として研究されている、特に、無水物粒子は、安定したタンパク質抗原の徐放性を提供し、抗原提示細胞を活性化し、免疫応答の2-12を変調する能力を実証した。
これらのワクチンキャリアの分子設計、ポリマー特性の合理的な選択と同様に適切な標的剤の取り込みを統合する必要があります。リガンドとの官能粒子を標的とのハイスループット自動化された製造は、広いrを勉強する能力を向上させる強力なツールです。プロパティのアンジュと再現性のワクチン送達デバイスの設計につながるだろう。
10,11,13 C型レクチン受容体（のCLR）が上に存在する炭水化物を認識するパターン認識受容体（PRRS）は、免疫細胞上の特定の受容体により認識されることができる標的リガンドを加え調節することが示されており、合わせて免疫応答病原体の表面。のCLRを介した免疫細胞の刺激は、抗原、さらにT細胞の活性化14,15の後続のプレゼンテーションの強化された内在化が可能になります。したがって、炭水化物分子が免疫応答の研究に重要な役割を果たしているが、これらの生体分子の使用は、しばしば構造的によく定義されており、純粋な炭水化物の可用性の欠如に苦しんでいる。液相反応を反復に基づいて自動化プラットフォームでは、有意に低いbを使用して、これらの合成に挑戦分子の迅速かつ制御された合成を有効にすることができます従来の固相方法16,17よりもブロックの数量をuilding。
ここに我々はこのような中間精製用フルオラス固相抽出とマンノースベースの標的リガンドとして糖鎖の自動化された液相合成のためのプロトコルを報告します。炭水化物ベースの標的化剤を作るための自動化手法の開発後、我々は以前に10を説明したようにLabVIEWで動作し、自動ロボットのセットを採用した無水物ナノ粒子の表面に、その添付ファイルの方法について説明します。炭水化物と表面官能はのCLRの10,11をターゲットに 、マルチパラメトリックシステムに関連付けられている複雑さが大きな価値（ 図1a）になります発掘に製造方法のスループットを増加させる効果を示している。
Protocol
1。ハイスループット糖鎖合成
- 前のdimannosideの自動合成に、適切に保護された糖供与体、通常はトリクロロと、アクセプターは、主にアルケニルフルオラスアルコールは、ベンチの上に合成される。
- プログラムはdimannosideの自動合成のために書かれています。基本的な自動化手順の概略図を図2に示されています。プログラムでは、プロモーターを添加する前に、ドナーとアクセプターの混合物を少なくとも30分間攪拌することが保証される。
- 合成ドナー、アクセプターとtrimethylsilyltrifluoromethanesulfonateの溶液をジクロロメタンで作られています。トルエン、ジクロロメタンは、グリコシル化反応のために最も頻繁に使用されています。
- また、80％メタノール、100％メタノールで一時的な保護基の脱保護するための試薬の溶液を調製する。
- プログラムの開始前に、確実にそのrelat客室内にIVEの湿度が自動化チャンバ内の30％以上低くなっています。高湿度では、グリコシル化反応のために有害である。
- プログラムが開始されると、ロボットアームを順次反応バイアルにドナーとアクセプターのソリューションを転送します。その後、混合物を30分間撹拌する。
- -20のような低い温度は、°Cを達成することができる一般的に混合物にロボットアームの転送trimethylsilyltrifluoromethanesulfonateの0.2から0.3当量を、室温で次が。反応混合物を30分間撹拌する。
- 30分後、反応を停止し、小アリコートは、反応の進行状況を監視するために削除されます。完了していない場合は、反応を継続することができ、最終的に必要な時間は変更することができます。
- 反応が完了したら、反応混合物を精製するためのC 8 F 17で修飾されたシリカゲルを含むフルオラス固相抽出（FSPE）カートリッジに転送されます。
- カート尾根は、最初の非フルオラス分を取り除くために80％メタノール - 水混合物（8 mL）で洗浄されています。
- その後、カートリッジが望ましいフルオラス·タグ付きの製品を得るために100％メタノールで洗浄されています。追加の精製が必要な場合は、マシンが停止し、反応生成物（s）は、追加の手段によって精製するために削除することができます。
- 精製サイクルの後、ロボットアームを反応バイアルにナトリウムメトキシドを分配します。反応は、2時間撹拌した。完了していない場合は、この反応は、再び長い期間継続することができ、最終的に必要なプログラムされた時間を変更することができます。
- 反応終了後、製品はFSPEにより精製された後、残留水を除去するために蒸発させ、無水トルエンに溶解に供した。
- 所望の鎖長が標的分子について得られるまで、このサイクルは、（ステップ6から13から）が繰り返されます。
- 自動化から得られた保護された製品は番目です。本発明は、さらに精製し、完全にそのような核磁気共鳴（NMR）分光法などの技法を特徴とする。それは、通常、爆発性の水素ガスとパラジウムが含まれるため、最終的な標的分子の完全な脱保護（残りのすべての保護基の除去）は、ルールとしてオートメーションプラットフォームの外で完了します。最後の脱保護工程は、オートメーション·プラットフォームの外にベンチ上で行った。最初のステップは、カルボン酸の生成したアルデヒドの酸化に続いてフルオラスタグの二重結合のオゾン分解であった。生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。最後のステップでは、パラジウム触媒の水素化によってベンジルエーテル基の脱保護した。製品は、純粋な最終製品を得るためにパラジウムを取り除くためにセライトパッドに通した。
2。ハイスループットナノ粒子表面の機能化
- ハイスループットポリマーの合成とナノ粒子の製造は同じPR以下の実施されotocolとロボットは、最大ピーターセンら 19で説明した設定します。粒子の製造に使用される共重合体システムは、セバシン酸（SA）と1,6 -ビス（ パラ -カルボキシフェノキシ）ヘキサン（CPH）、1,8 -ビス（に基づいています。 パラ -カルボキシフェノキシ）-3,6 -ジオキサオクタン（CPTEG）とCPH。利用ロボットの蒸着装置の概略図は図1bに示されています。
- ナノ粒子の作製に続いて、ナノ粒子のライブラリを使用してチューブを含むホルダはリニアアクチュエータ、ステージに再接続されています。
- 無水物粒子の表面に炭水化物の添付ファイルでは、2つの連続した反応から成るアミン-カルボン酸カップリング反応20が実行されます。
- 最初の反応は、最初のプログラマブルシリンジポンプのシリンジが10当量の（式）（粒子表面の平均モルのカルボン酸濃度の当量）で満たされている1 - エチル-3 - （3 - ジメチルアミノプロピル）-CArbodiimide塩酸塩（EDC）と10当量。水溶液中でエチレンジアミン、第プログラマブルシリンジポンプのシリンジは、12式がロードされている。水溶液中でN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）の。
- LabVIEWプログラムを使用して、試薬の懸濁液は、ナノ粒子のライブラリ*に堆積される。
- 次に、各サンプルは超音波処理されている（40 Hzで30秒）と、チューブホルダーは、ロボットプラットフォームから切り離されます。
- ナノ粒子懸濁液を4℃で一定の回転で9時間**をインキュベートする
- 反応時間が完了した後、チューブを遠心（5分間12000×gで）と二つの洗浄手順を実行するロボットステーションに返されます。
- 第2シリンジポンプのシリンジを冷たい水で満たされている間に洗浄するために、注射器は空になり、最初のプログラマブルシリンジポンプにロードされたままになります。各チューブの上清は、空の注射器と第2ポンプ預金冷たい水の中に撤回されています。
- ナノの均質化ステップ2.6で説明したように粒子懸濁液が実行されます。チューブを遠心分離されている（5分間12000×g）で、ステップ2.9で説明されているように第二洗浄工程が実行されます。
- 第二の反応は、2つの成膜工程が使用されます。第一の蒸着工程においては、12式。 EDCの一つのポンプと12式で読み込まれます。 NHSの第二のポンプがロードされます。
- 第2の堆積工程は、10当量が含まれています。第一および第二ポンプ（すなわち、ガラクトース、ラクトースまたはジ-マンノース）***と10当量の第3ポンプ上の特定の糖の。のグリコール酸（コントロールとして使用****）。
- 4℃ステップ2.6で記述され、一定の回転で9時間インキュベートしたとして、ナノ粒子懸濁液を均質化される
- 反応時間が完了した後、手順2.8、2.9および2.10で説明したように、洗浄工程が実行されます。
- 官能ナノ粒子のライブラリは、少なくとも2時間乾燥させ、真空チャンバ内に配置されています。
- 官能性ナノ粒子は、その後の文字です。X線光電子分光法は、それぞれ表面組成と糖の濃度を決定するためのハイスループットフェノール硫酸アッセイによって特徴づけ。電子顕微鏡法と動的光散乱をスキャンすると粒子サイズ、サイズ分布、表面電荷を決定するために利用されています。
注：*沈着量が各チューブに含まれるナノ粒子の質量によって異なります。
第一および第二反応の**反応時間は、最終的な糖濃度を調整するために変更することができます。
***各糖は、目的のグループに応じて試験管に堆積される。
脱糖は既にナノ粒子表面にさらに添付ファイルを可能にする共有結合し、この分子を持っているので、****炭水化物の結合のため、本研究で用いられる特定の反応については、グリコール酸は、リンカーの制御として使用されます。
3。代表的な結果
FUL図2に示すように、LY保護dimannosideは、自動化プラットフォームを用いて合成した。合成した化合物は、溶媒としてCDCl 3を用いてVXR 400 MHzの分光計で1 H NMRによって特徴付けられた。 NMRスペクトルを図3に示します。
無水物のハイスループットナノ粒子の作製と機能化を利用すると、本明細書に記載のナノ粒子は、dimannose、ラクトースおよびガラクトースの添付ファイルが正常に10、11に行われている。このセットを使用して、最適な反応条件（すなわち、反応温度と時間）は、所望のナノ粒子の機能化と形態を達成するために、同定された。反応は4℃で行った時°Cの代わりに室温で、ナノ粒子凝集の低下をSEMで観察した（データは示さず）。表1は、官能50:50 CPTEGの特性の代表的な結果を示しています。ジ-マンノースのいずれかでCPHナノ粒子または4で合成された乳糖、℃データは、官能基による平均粒子径の小さな増加を示している。非官能化ナノ粒子は約負のゼータ電位を有した。 -20 mVの、官能粒子は、ナノ粒子表面の正常な機能化を示す、正のゼータ電位値を示した。乳糖およびジ-マンノースは、両方の中性糖であるが、エチレンから遊離アミングループは、糖類を添付するために使用リンカは正のゼータ電位の責任があるかもしれませんジアミン。
反応時間は、ナノ粒子の最終的な形態と達成された砂糖の添付ファイルの程度の両方に影響を与える可能性があり、別の変数です。反応時間を調整することにより、ナノ粒子表面に付着し、最終的な糖濃度は、 図4Aに示すように制御することができます。予想通り、50:50 CPTEGの表面上のdimannoseの濃度：CPHは、ナノ粒子と共に増加反応の合計時間および18時間後に最大に達した。 24時間の総反応時間で官能ナノ粒子がマウス骨髄由来の樹状細胞（DC）上のCLRを対象とする彼らの能力を評価するために使用された。フローサイトメトリーは、2 CL受容体（すなわち、CIRE（CD209、DC-SIGN）とマンノース受容体（CD206））非官能で刺激した後、乳糖およびジ-マンノース官能性ナノ粒子（ 図4B）の発現を評価するために使用されていました。細胞は、乳糖およびジ-マンノースの官能ナノ粒子の両方を刺激したときに効果的なターゲティングを示している両方の受容体の高い発現は、得られた。しかし、ジ-マンノース官能粒子が研究された受容体は、このリガンドの特異性を示す発現の高いレベルを示した。
| ナノ粒子の種類 | 平均粒子径（nm）の | アベニュー激怒粒子ζ-電位（mV） |
| 非官能 | 162±43 | -20±0.6 |
| 乳糖 | 235±34 | 26±2.4 |
| ジ-マンノース | 243±32 | 30±4.2 |
表1。ナノ粒子のキャラクタリゼーション。非官能、官能は、準弾性光散乱とゼータ電位の測定によって特徴付けられた。粒度のデータは平均値±3つの独立した実験で収集された動的光散乱データの標準偏差（SD）を表す。ゼータ電位のデータは平均値±3の独立した測定値のSDを表しています。 CPHナノ粒子表面：ゼータ電位の符号の変化は、砂糖が50:50 CPTEGに効率的に結合させたを示しています。
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図1糖無水物ナノ粒子の機能化と説明したハイスループットなアプローチで設計することができる官能基ナノ粒子のライブラリの例を追求したアプローチの（A）グラフィカルな表現。 （B）自動化された蒸着装置の模式図は、（i）3 NE千ポンプで構成されて粒子の機能化、のために利用し、（ii）ロボットのステージでは、2つのアクチュエータ（Zaber）によって統合された：x方向の運動のためのものと他のy方向の移動のための、3アクチュエータから成る二つの隣接するラック（チューブやキュベットに適した）、各方向に1つ（x、y、およびz）と（ⅲ）第二段階のロボット。ポンプとアクチュエータ5の合計は、直列に接続されています。アクチュエータとポンプは、LabVIEWソフトウェアを使用してコンピュータによって運営されています。この図は、スケールにはありません。arge.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
図2の例としてマンノースを使用して、炭水化物の自動反復合成のグラフィカル表現です。
図3。保護dimannosideの1 H NMR。
図4（A） 糖鎖のナノ粒子表面濃度の反応時間の影響。示されたデータでは、50:50 CPTEG：CPHナノ粒子は、異なる反応時間でdimannoseで官能され、反応は4℃で行った二つの独立した官能の実験の平均と標準誤差が示されています。 （B）乳糖およびジ-マンノース官能性ナノ粒子得られた発現と比較してCPHナノ粒子：骨の官能50:50 CPTEGによる刺激後にこれらの2つのマーカーの発現増強によって示されるように骨髄由来樹状細胞上で効果的にターゲットDC-SIGN（CIRE、CD209）とマンノース受容体（CD206）非官能化粒子と。
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Discussion
免疫細胞に直接ナノ粒子の相互作用に薬剤を標的として炭水化物の効果は以前に10、11に実証されている。私たちの研究室でこれまでの研究では、それによってさらにT細胞の活性化10、11のために重要であるかもしれない免疫細胞の活性を高め、無水物ナノ粒子に接続された特定の糖鎖は抗原提示細胞（APC）上で異なるのCLRをターゲットにすることができることが示されている。しかし、最適なターゲットにいくつかのパラメータ - このような無水物の化学的性質、サイズなどを達成するために、砂糖または表面の砂糖の種類を最適化する密度必要がありますので、このようなマルチパラメトリックシステムに関連付けられている発掘複雑に製造方法でスループットを向上させる大きな値になります。加えて、バイオセンシング、酵素固定化し、foodbの検出などの研究の他の関連分野への大きな値の場合の官能ナノ粒子の使用オルヌ病原体。
炭水化物の説明したハイスループット合成を利用することにより、炭水化物の分子の再現性の合成における課題を軽減することができます。同じ砂糖の自動並列反応は、必要に応じて材料の大量を生成することができます。糖と糖の知られている役割は急速に拡大しています。それにもかかわらず、多くのプロセスにおいて炭水化物の分子メカニズムの理解、例えば、シグナル伝達経路や細胞認識プロセス21は 、構造的に明確に定義された糖類を簡単かつ安価な可用性に依存しています。正確な鎖延長するためのさまざまな水酸基の反応性を制御するために保護/脱保護戦略は糖合成のための主要な必要条件ですが、手間と時間がかかります。オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドは、定期的かつ効率的に自動化されたシンセサイザー22、23を使用することによって合成される。固相シンセサイザはAVAであるオリゴ糖の合成24 ilableが、いくつかの重大な欠点に苦しむ：ビルディング·ブロックの、例えば大過剰（ステップカップリング当たり5〜20当量）、反応の進行の容易な監視の欠如、および使用される固相樹脂の固有の変動性。新しい液相自動化プラットフォームは、しかし、これらの貴重なビルディング·ブロックのわずか2〜3当量を必要とします。このプラットフォームでは、そのようなアルケニルフルオラスグループとしてフルオラスさまざまなタグは、非フルオラス化合物18、25、26から容易に中間生成物を精製するためにフルオラス固相抽出（FSPE）を有効にします。ここに示すようにしかし、これらのタグは標準的な有機溶媒中で液相グリコシル化および脱保護反応を排除するものではありません。また、任意の固相自動合成とは異なり、この新しいプラットフォームは、このような質量分析（MS）と任意の段階で薄層クロマトグラフィー（TLC）などの標準的な反応モニタリング戦略を可能にします。
ontent ">として記載のナノ粒子の高スループット機能化に続いて、結果のセクションで説明したように、反応条件（例えば、反応時間と温度）官能基が最適化された後、最適なナノ粒子の形態を達成するために。最適な反応温度を最適化する必要があるかもしれませんナノ粒子（例えば、ガラス転移温度（T g）が、分解速度）を製造するために使用されるポリマーの特性に応じて、例えば、低T g（室温以下）を有するポリマーを使用する場合は、官能化反応で実施する必要があります。我々の研究グループで利用無水物の化学的性質のいくつかのケースで低い温度は、粒子の機能化のために採用し、総反応時間の最適化は、異なる分解速度を持つ粒子の化学は官能する必要がある場合は特に望まれている。短い反応時間は理想的かもしれませんバルク浸食材料eを官能化する特にターゲットと砂糖は、薬物またはタンパク質にロードされた粒子に付着する必要があるとき。粒子表面上の糖濃度は、これらのキャリアの生物学的なパフォーマンスを指示する重要な変数である可能性があります。糖濃度を変化させる生物学的結果は、我々の研究室における研究の現在の領域です。このハイスループットの使用が製作するように設定さと官能性無水物ナノ粒子は速く、従来の作製と機能化の方法よりも、複数の変数のテストを行うことができます。ハイスループット技術の主な制限は、それが装置のホルダーに合うことができるコンテナのサイズによって制限されているので得ることができ、粒子の最大バッチサイズである場合：しかし、このセットの主な用途はアップスクリーニングのためのものですので、小さいサイズのバッチを効率的にこの目的のために使用することができます。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NLBPは、共同設立者であり、炭水化物会社LuCellaバイオサイエンス株式会社の株式を保持している
Acknowledgments
著者らは、財政支援のために米陸軍医学研究および資材コマンド（＃W81XWH-10-1から0806を付与）と国立衛生研究所（グラント＃U19 AI091031-01とグラント＃1R01GM090280）に感謝したいと思います。 BNは化学と生物工学のBalloun教授職を認識しNLBPは、学際的な工学のウィルキンソン教授職を認めるものです。我々は、ナノ粒子の機能化実験を行うには彼女の援助のためにジュリア·ベラに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| ASW 1000 | Chemspeed Technologies | ||
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| XL-2000 Sonicator | Qsonica | Q55 | |
| Mini-tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 |
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