Summary
Наночастицы, таких как полупроводниковые квантовые точки (КТ), могут быть использованы для создания фотоактивируемых агентов антимикробные или анти-рак приложений. Этот метод показывает, как с водой растворить теллурида кадмия (CdTe) КТ, сопряженные им антибиотики, а также выполнять бактериального ингибирования основе кривых роста и пластины кол.
Protocol
1. КТ Солюбилизация
Этот метод подходит для CdTe. Подобные методы могут быть использованы и другие типы квантовых точек, таких как InP / ZnS 20 и CdSe / ZnS 21.
- Приготовьте раствор CdTe квантовых точек в толуоле при 15 мкм (оптическая плотность = 2,5 в первом экситонного пика).
- Передача 200 мкл этой акции в стеклянный флакон. Не используйте пластиковые!
- Добавить 800 мкл толуол, 1 мл 200 мМ боратного буфера (рН 9) и 2 мкл 11,5 M меркаптопропионовой кислоты (MPA).
- Закройте флакон и энергично встряхните его в течение 30-60 секунд.
- Водных и органических растворителей фазы будет отделить спонтанно. Водная фаза станет цвет КТ. Чтобы избежать толуол слой, удалите его и отбросить его. Затем перенесите в водную фазу в чистый флакон.
- Очисти растворяются КТ промывкой / фильтрации в четыре раза использовании 500 мкл, 10000 молекулярная масса отсечки центрифугу фильтром. Фильтры должны бытьнити при 3000 мкг в течение 13 минут. По крайней мере, последние два моет, промыть желаемого буфера.
- После последней промывки, приостановить промытый КТ в 50 мМ буфере бората в нужной рН и хранить при 4 ° C. Они будут стабильными в течение 1-2 недель.
- Измерение поглощения и спектры излучения для оценки концентрации основан на опубликованной формулы 22.
Представитель результаты: На рисунке 1 показаны изображения КТ CdTe под действием УФ-лампа подсветки, а также спектры излучения до и после растворения воды, показав незначительное изменение с крышкой обмена. Размер значения диаметра сердцевины измеряется с помощью электронного микроскопа.
2. КТ сопряжения с антибиотиком
Эта часть протокола применима к любой отрицательно заряженные воде растворенного наночастиц, в том числе большинство коммерческих КТ, металлические частицы и т.д. 19.
- Любая молекула будет работать, что eithэ самостоятельно собирает в отрицательно заряженные растворяются КТ, или что есть реактивная группа, которая может быть сопряжена, например, первичные амины. В этом примере мы используем полимиксина (PMB), которая заряжена положительно и самостоятельно собирает без необходимости сопряжения реагентов. Растворите PMB в H 2 O при 60 мкМ. (Если выбранный антибиотик не растворяется в H 2 O, растворяется в ДМСО или этанол в концентрации 0,1-1 мм). Это будет 10-кратным решения (в H 2 O) или 100x раствора (растворителя).
- Посчитайте, сколько КТ решение необходимо для бактериальной экспериментов токсичности. Для 96-луночный планшет с 0,3 мл на лунку в quadruplicates, 0,5 мл 200 нМ сопряженных необходимо. Приготовьте два пробирки, содержащие по 100 мкл 1 мкМ квантовых точек в 50 мМ буфере бората.
- Если связь с первичным амином, подготовить 19 мг / мл (100 ммоль) раствора 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимида гидрохлорид (EDC) в H 2 O. EDC в решение не является устойчивым, Немедленно использовать и выбросить остальное же.
- Добавить 50 мкл 10x раствор антибиотика (в H 2 O) или 5 мкл 100x решения (в растворителе) сопряженной трубы. Для PMB: CdTe сопряжения в молярном соотношении 30:1, добавить 50 мкл 60 мкМ PMB. Добавить H 2 O или растворителем для КТ только трубки контроля.
- Если необходимо, добавьте 1 мл раствора EDC акции сопряженных трубку.
- Вызовите сопряженных объем до 0,5 мл соответствующего буфера (боратный буфер или PBS, не содержащие амины, такие как буфер Трис, как они будут препятствовать EDC).
- Щит труб от света алюминиевой фольгой, и место на nutator или рокер в течение 1 часа. Если агрегация происходит, повторите сопряжение с более низкими концентрациями антибиотика. Титруйте концентрация вверх, пока частиц не агрегат.
- Вымойте конъюгатов, проходя через соответствующий фильтр. 10000 молекулярный вес отсечка работает для большинства антибиотиков, но не для белков или антител. В зависимости от молекулы, различные методы могут быть использованы для оценки количества антибиотиков молекул в КТ: поглощение или флуоресцентной спектроскопии, гель-электрофорез, или преобразование Фурье ИК-спектроскопии (ИК).
Представитель результаты. В этом примере PMB сопряжения характеризуется изменениями в КТ спектра излучения. На рисунке 2 показаны спектры CdTe КТ с PMB дополнение.
3. Подготовка бактерий в течение 96-и экрана, определения антибиотиков IC 50
Это относится практически к любой штамм бактерий, выращенных в соответствующей среде 18. Точная продолжительность записи следует продолжать зависит от бактериального роста. В нашем примере мы используем кишечной палочки, выращенные в лизогении бульон (LB) среды.
- Для того, чтобы выбрать подходящий КТ концентрации сопряжены, важно знатьIC 50 антибиотик быть сопряжены и, если КТ сами по себе токсичны. Это должно быть начато за 2 дня до сопряжения эксперимента. Вечером, семян 10 мл бактериальной питательной среде из свежих колонии, используя правильный стерильные и биологической техники.
- На следующий день за 1-2 часа до эксперимента, заполнить каждую из скважин ясно дно 96-луночного планшета с почти-максимальное количество питательной среде. Используя многоканальную пипетку, семян в каждую лунку с 1-50 мкл бактериальной культуры (концентрация будет зависеть от того, как быстро конкретный штамм растет и нужно будет калибровать вашей лаборатории).
- Поместите пластину на ридер и установить его для чтения каждые 10 минут в течение 2 часов при определенной длине волны (обычно 600 нм). Следить за тарелку так, чтобы бактерии не растут слишком плотно слишком быстро.
- Когда клетки все достижения OD = 0,1-0,15, удалить пластину из ридер и остановить запись.
- Добавить наркотиков в одиночку и только в КТразличной концентрации, по крайней мере triplicates. Используйте одну сторону пластинки, как "темный" контроль и половина для освещения. Предлагаемая схема приведена на рис 3. Концентрация должна охватить достаточно широкий диапазон включить один концентрации, подавляет бактерии, очень мало, и тот, который убивает их всех.
- Щит "темной" стороне пластины с алюминиевой фольгой. Вынести другой стороны, чтобы лампа на нужную длину волны. Мы используем пользовательский 96-а, 440-нм лампы из светодиодов 2,4 мВт (рис. 4) и облучают в течение 30-60 мин. Черные пластины с четко днища помочь защитить неэкспонированные бактерий из рассеянного света. Пустая колонка также может быть использована между экспозицией и ООН, подвергшихся воздействию сторон.
- После того, как освещенность, поставил пластинку в планшетов и запись OD 600 каждые 10 минут на 5-12 часов в зависимости от темпов роста. Держите температура <32 ° C, если возможно, чтобы избежать высыхания культур.
- Постройте кривые ростав выбранной точке времени по сравнению журнал [концентрации] и определения IC 50 антибиотиков с помощью уравнения Hill:
где Н-коэффициент Хилла, у макс является самой высокой точкой роста (в идеале на плато), и у мин является нулевым, и в идеале на плато. Маловероятно, что КТ только покажет гораздо токсичности для клеток в используемых концентрациях, поэтому значение не будет определено.
Представитель результаты. В конце периода записи, ясно скважин показывают полную гибель клеток, и градиент плотности клеток должны появиться по повышению концентрации препарата. Бактерии должны показать S-образный рост кривых (рис. 5), положение максимума плато будут существенно отличаться от штамма к штамму, а также зависит от температуры. Данный момент времени может бытьвыбрана в качестве представителя и значения нанесены против Вход [антибиотик], чтобы дать IC 50 (рис. 5 б). Для оценки токсичности КТ, выживание против Вход [QD] также могут быть построены, но достижение значительных бактериальных убийства с КТ только редко (рис. 5 С).
4. Подготовка бактерий в течение 96-и экран с антибиотиками / КТ
- За день до эксперимента, семян 10 мл культуры с новой колонии в соответствующие богатой среде, используя правильный стерильные и биологической техники. QD-антибиотик сопряженных должны быть готовы в этот день, если это крайне нестабильной.
- 1-2 часа до начала эксперимента, заполнить каждую из скважин ясно дно 96-луночного планшета с почти-максимальное количество питательной среде. Используя многоканальную пипетку, семян в каждую лунку с 1-50 мкл бактериальной культуры.
- Поместите пластину на ридер и установить его для чтения каждые 10 минут в течение 2 часов при той же длине волны, как в части 3.
- Когда клетки все достижения OD = 0,1-0,15, удалить пластину из ридер и остановить запись.
- Добавить КТ конъюгатов при различных концентрациях по крайней мере в четырех экземплярах. Используйте одну сторону пластинки, как "темный" контроль и половина для освещения. Предлагаемая схема приведена на рис 6. Бактерии только контрольная полоска должна всегда быть включен в случае проблем, связанных с культурой, температура и т.д. влияют на условия роста. Одной полосой наркотиков только и только КТ также должны быть включены, чтобы они соответствовали контроль пластина сделана ранее. Остальные скважины предназначены для конъюгатов для того, чтобы обеспечить хорошую статистику.
- Щит "темной" стороне пластины с алюминиевой фольгой. Вынести другой стороны, чтобы лампа на нужную длину волны.
- После того, как освещенность, поставил пластинку в планшетов и запись OD 600 каждые 10 минут на 5-12 часов. Держите температура <32 ° C, по возможности, избежать др.инь культур.
Представитель результаты. Сочетание КТ и антибиотиков может быть менее токсичен, чем антибиотик в одиночку, одинаково токсичны, или более токсичны. Это может быть количественно, используя кривые роста и IC 50 измерений. На рисунке 7 показан пример конъюгатов, одинаково токсичны как антибиотик в одиночку, и пример конъюгатов, которые являются более токсичными.
5. Пластина графа
- Выберите один или несколько скважин обработанных 96-луночного планшета, который будет использоваться для последовательного разведения и колонии счета.
- Сделать серийного разведения каждого из выбранных бактериальные образцы с PBS или физиологическим раствором (0,9% NaCl). Трансфер 20 мкл бактериальной решения и развести его с 180 мкл физиологического раствора, изменить кончик пипетки, перемешать и перенести 20 мкл разбавленного бактериальных решение до 180 мкл физиологического раствора. Повторить 6 раз.
- Возьмите 10 мкл из каждого разведения и пластины на соответствующие твердые пластины СМИ. Все 8 концентрации одного образца могут быть покрыты на 10 см вокруг чашки Петри, хотя прямоугольные блюда предпочтительнее, так как легче выстроить вещи.
- Дайте высохнуть на скамейке запасных в течение 15 мин. затем инкубировать в соответствующей температуры для бактерий в течение 16 часов.
- Граф колоний и рассчитать колониеобразующих единиц (КОЕ) в соответствии с (# колоний х коэффициент разбавления) / объем покрытием = КОЕ / мл.
На рисунке 8 показан пример пластины КОЕ.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1. CdTe квантовых точек. (A) Восемь препаратов КТ CdTe освещается УФ палочка (365 нм). (B) поглощения и испускания из пяти выбранных размеров до и после растворения воды. Пунктирные линии спектра в толуоле, сплошные линии находятся в воде.
files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Спектральные и гель анализа КТ-PMB конъюгатов. Оранжево-излучающих КТ CdTe были использованы для этого примера влияния на другие типы квантовых точек нужно будет оцениваться для каждого эксперимента. (А) Типичное абсорбции (серая линия) и спектры излучения (черная линия) КТ до сопряжения PMB и излучения (пунктирная линия) после добавления 160 молярных эквивалентов PMB. (Б) отношения между отношением PMB и КТ интенсивности излучения (квадраты) и пик волны месте (треугольники).
Рисунок 3. Предлагаемое расположение пластин для контроля пластин роста. Широкий спектр PMB и КТ концентрации представлена. Одна половина пластинки облучают (выделены синим цветом), и такая же половина защищенном от света месте. Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.
Рисунок 4. Пользовательские 96-светодиодные лампы для равномерного облучения пластины, показывающий появление время от времени. Типичный ручной УФ-лампы также могут быть использованы, но не покроет всей пластинки равномерно.
Рисунок 5. Пример результатов для контроля пластин роста. (А) представитель бактериальной кривых роста с различной концентрацией препарата, от 0 до завершения гибели клеток. Открытые символы PMB только с концентрацией данного; твердой символы CdTe-PMB без облучения, а наполовину заполненной символы CdTe-PMB с облучением. Облучение не влияло на PMB только образцы, так что эти кривые были опущены для ясности. Все PMB-CdTe сопряженные 30:1 PMB: КТ отношений. (B) Участки значений кривой роста на 200 мин против Вход [PMB] и соответствует формуле. (1). В продолжениеРОЛ эффектов света, кривой осуществляется с помощью антибиотиков только 30 минут освещенности. (C) Бактериальный выживания на 200 минут по сравнению с КТ концентрации, используя CdTe квантовых точек. Некоторые токсичности наблюдается с освещенности, но слишком мало, чтобы определить значение IC 50. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 6. Предлагаемая схема для сопряженных пластинка теста. Сине-подчеркнул половина пластины должны подвергаться воздействию света, а unhighlighted половина защищены. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 7. Пример результатов для сопряженных пластинка теста. Кривая роста стоимости на 200 мин были плotted и подходит к уравнению. (1). (А)-CdTe PMB конъюгатов шоу увеличилась токсичность по PMB в одиночку. (B) наночастиц золота Au-PMB конъюгаты не проявляют токсичность увеличился на PMB в одиночку.
Рисунок 8. Пример пластины КОЕ. Е. палочки посеяны в 96-луночного планшета обрабатывали QD-PMB с или без облучения в течение 30 мин. Затем инкубировали при 32 ° C в течение 4 часов. Серийные разведения каждого бактериальных образцов были сделаны с физиологическим раствором, и 10 мкл 100 X 10 X 7 разведения высевали на агар пластин. Пластины инкубировали при 37 ° C и колонии были подсчитаны после 16 часов. Пластина показывает разведения по рядам, как указано, столбцы: (A) 0,06 мкм PMB + 2 нм CdTe, (Б) 0,12 мкм PMB + 4 нМ CdTe (C) 0,2 мкМ PMB + 6,7 нМ CdTe, (D) 0,06 мкм PMB + 2 нм CdTe облучении (E) 0,12 мкм PMB + 4 нМ CdTe облучении (F) 0.2 мкм PMB + 6,7 нМ CdTe облучениянеоблученных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наночастицы представляют собой перспективный подход к созданию новых антимикробных агентов. Анализ роста кривой способ контроля бактериальной клеточной плотности, что отличает активно растущих клетках подавляется рост клеток. В сочетании с пластиной считает, она позволяет провести тщательный анализ антибиотиков потенциал сопряжены. 96-луночного формата позволяет сравнительно высокой пропускной вариации концентрации и других условий, таких как освещенность, последний имеет решающее значение для легких активированных веществ, таких как квантовые точки. Многие вариации на эту основных подхода возможно, что делает его универсальным методом нанотоксикологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NSERC Индивидуальная программа Discovery, NSERC / CIHR Совместная программа исследований в области здравоохранения (CHRP) и NSERC CREATE канадский астробиологии Training Program (CATP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borate Buffer Component #1 | Fisher | Boric acid A-74-1 | |
| Borate Buffer Component #2 | Sigma-Aldrich | Sodium Tetraborate B9876 | |
| MPA | Sigma-Aldrich | M5801 | |
| Vivaspin 500 | GE Healthcare | 28-9322 | Various MWCO available |
| Glass vials | Fisher | 03-338C | |
| EDC | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| Polymyxin B | Sigma-Aldrich | P1004 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #1 | Fisher | NaCl S271 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #2 | BD | Tryptone 211705 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #3 | BD | Yeast Extract 211929 | |
| Lamp for light exposure | Custom | ||
| Clear-bottom 96-well plates | Fisher | 07-200-567 or 07-200-730 | |
| Fluorescence spectrometer | Molecular Devices | ||
| Absorbance plate reader | Molecular Devices | ||
| BactoAgar for solid media | Bioshop | AGR001.1 | |
| Petri dishes round | Fisher | 08-75-12 | |
| Petri dishes rectangular | Fisher | 08-757-11A |
References
- Michalet, X. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Jamieson, T.
- Asokan, S. The use of heat transfer fluids in the synthesis of high-quality CdSe quantum dots, core/shell quantum dots, and quantum rods. Nanotechnology. 16, 2000-2011 (2005).
- Chan, W. C. W. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol. 13, 40-46 (2002).
- Chan, W. C. W., Nie, S. M. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science. 281, 2016-2018 (1998).
- Biju, V., Itoh, T., Ishikawa, M. Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging. Chem. Soc. Rev. 39, 3031-3056 (2010).
- Boucher, H. W. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clin. Infect. Dis. 48, 1-12 (2009).
- Morones, J. R. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16, 2346-2353 (2005).
- Mitoraj, D. Visible light inactivation of bacteria and fungi by modified titanium dioxide. Photochemical & Photobiological Sciences. 6, 642-648 (2007).
- Fu, G., Vary, P. S., Lin, C. T. Anatase TiO2 nanocomposites for antimicrobial coatings. J. Phys. Chem. B. 109, 8889-8898 (2005).
- Chung, C. J., Lin, H. I., Tsou, H. K., Shi, Z. Y., He, J. L. An antimicrobial TiO2 coating for reducing hospital-acquired infection. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 85, 220-224 (2008).
- Nair, S. Role of size scale of ZnO nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, Suppl . 1. S235-S241 (2009).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Rincon, A. G., Pulgarin, C. Use of coaxial photocatalytic reactor (CAPHORE) in the TiO2 photo-assisted treatment of mixed Escherichia coli and Bacillus subtilis and the bacterial community present in wastewater. Catal. Today. 101, 331-344 (2005).
- Neal, A. L. What can be inferred from bacterium-nanoparticle interactions about the potential consequences of environmental exposure to nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 362-371 (2008).
- Kovochich, M. Comparative toxicity of C60 aggregates toward mammalian cells: role of tetrahydrofuran (THF) decomposition. Environ. Sci. Technol. 43, 6378-6384 (2009).
- Hoshino, A. Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification. Nano Letters. 4, 2163-2169 (2004).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Park, S., Chibli, H., Wong, J., Nadeau, J. L. Antimicrobial activity and cellular toxicity of nanoparticle-polymyxin B conjugates. Nanotechnology. 22, 185101 (2011).
- Cooper, D. R., Dimitrijevic, N. M., Nadeau, J. L. Photosensitization of CdSe/ZnS QDs and reliability of assays for reactive oxygen species production. Nanoscale. 2, 114-121 (2010).
- Pong, B. K., Trout, B. L., Lee, J. Y. Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies. Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).
- Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. vander The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots. Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).
