Visualisering av Cortex Organisation och Dynamics i mikroorganismer, med total inre Mikroskopi fluorescens
Summary
Fluorescens vid total internreflexion (TIRF) mikroskopi är en kraftfull metod för att observera strukturer nära cellens yta vid hög kontrast och temporal upplösning. Vi visa hur TIRF kan användas för att studera protein-dynamiken vid cortex av cellväggen slutna bakterie-och svampceller.
Abstract
TIRF mikroskopi har blivit en kraftfull bildteknik för att studera spatio-temporala dynamiken i fluorescerande molekyler i in vitro och i levande celler 1. Det optiska fenomenet av total intern reflektion inträffar när ljus passerar från ett medium med högt brytningsindex i ett medium med lågt brytningsindex vid en vinkel större än en karakteristisk kritisk vinkel (dvs närmare att vara parallell med gränsen). Även om allt ljus reflekteras tillbaka under sådana förhållanden, är en försvinnande våg skapas som utbreder sig över och längs gränsen, som sönderfaller exponentiellt med avståndet, och endast tränger prov områden som är 100-200 nm nära gränssnittet 2. Förutom att tillhandahålla överlägsna axiell upplösning, ger den minskade excitering av oskarpa fluoroforer ett mycket högt signal-till-brusförhållanden och minimerar skadliga effekterna av fotoblekning 2,3. Att vara en widefield teknik gör TIRF också snabbare bilden ACFörvärvet än de flesta skanning baserade konfokala inställningar.
Vid första anblicken verkar låg penetration djup TIRF är oförenligt med avbildning av bakterie-och svamp celler, som ofta omges av tjocka cellväggar. Tvärtom, har vi funnit att cellväggarna av jäst och bakterieceller faktiskt förbättrar användbarheten av TIRF och öka utbudet av observerbara strukturer 4-8. Många cellulära processer kan därför direkt åtkomst till TIRF i små, encelliga mikroorganismer, som ofta erbjuder kraftfulla genetiska manipulation tekniker. Detta tillåter oss att genomföra in vivo biokemi experiment, där kinetiken av protein interaktioner och aktiviteter direkt kan bedömas i levande celler.
Vi beskriver här de olika steg som krävs för att få bilder med hög kvalitet TIRF för Saccharomyces cerevisiae eller Bacillus subtilis celler. Vi påpeka olika problem som kan Affect TIRF visualisering av fluorescerande prober i celler och illustrera proceduren med flera applikationsexempel. Slutligen visar vi hur TIRF bilder ytterligare kan förbättras med hjälp av etablerade tekniker bild restaurering.
Protocol
Discussion
TIRF mikroskopi är den teknik som väljs för att bilden perifera proteiner. Den låga penetrationen djup försvinnande området minimerar för oskarp ljus, vilket leder till en mycket bra signal-brus-förhållande och tillåter datainsamling med hög bildfrekvens, eller avbildning av mycket svagt uttryckta proteiner. Kombinationen av hög kontrast och hög chassi gör TIRF mikroskopi ett perfekt verktyg för avbildning spatio-temporala dynamiken i cortically lokaliserade proteiner. Intressant den tjocka cellväggen so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av Max Planck-sällskapet.
Materials
| Name of the tool/reagent | Type | Company | Catalogue number |
| Orbital Shaker | Tool | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscope | Till | Customized setup | |
| Glass container | Tool | Vitlab | 340-232880353 |
| Ceramic staining rack | Tool | Thomas Sci. | 8542E40 |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | L7647 |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Microscope | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Microscope Slides | Microscope | Menzel Gläser | AA00000102E |
| Immersion Oil | Microscope | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarose | Reagent | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagent | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
