Summary
全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、高コントラスト分解能と時間分解能で細胞表面に近い構造を観察するための強力なアプローチです。我々は、全反射は、細胞壁で囲まれた細菌や真菌細胞の皮質でのタンパク質のダイナミクスを研究するために用いることができる方法を示しています。
Abstract
全反射顕微鏡は、in vitroで、細胞1を生体内蛍光分子の時空間ダイナミクスを研究するための強力なイメージング技術として浮上してきました。特性臨界角（に近い境界と平行であることにIE）よりも大きい角度で低屈折率と培地中に高屈折率媒質から通過するとき光全反射の光学現象が発生します。すべての光がそのような条件下で反射されていますが、エバネッセント波は距離とともに指数関数的に減衰し、唯一のインターフェイス2の近くに100から200 nmであるサンプル領域を貫通して境界を越えてとに沿って伝播し、作成されます。優れた軸方向の分解能を提供することに加えて、焦点蛍光体のうちの低下励起対雑音比が非常に高い信号を生成し、2,3退色の有害な影響を最小限に抑えます。広視野のテクニックなので、全反射も高速な画像交流できます。ほとんどのスキャンベースの共焦点顕微鏡のセットアップよりquisition。
一見すると、全反射の低浸透深さは、多くの場合、厚い細胞壁で囲まれている細菌および真菌細胞のイメージングと互換性がないと思われる。それどころか、我々は酵母や細菌の細胞の細胞壁は、実際に全反射の使いやすさを向上させ、観察可能な構造を4-8の範囲を広げることを発見した。多くの細胞プロセスは、したがって、直接、しばしば強力な遺伝子操作技術を提供する小さな、単一細胞微生物で全反射によってアクセスすることができます。これは、私たちはタンパク質相互作用や活動の動態を直接生きた細胞で評価することができるin vivoで生化学の実験で行うことができます。
ここではサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）または枯草菌細胞のための高品質の全反射画像を得るために必要な個々の手順について説明します。我々はaffeできる様々な問題点を指摘CT TIRFは、細胞内蛍光プローブの可視化といくつかのアプリケーション例と手順を示しています。最後に、全反射画像がさらに確立された画像復元技術を使用して改善することができる方法を示しています。
Protocol
1。試料調製
- カバースリップの準備
TIRFは、カバースリップ（ 図1A、映画1）に起因するバックグラウンドシグナルに敏感であるとして、カバーガラスは、ダスト粒子からきれいにする必要があります。- 蓋付きセラミックホルダーに鉗子場所カバースリップを使用します。
- 1 MのNaOH（複数回再利用することができます）でガラス容器を埋める。
- 低速連続回転（オービタルシェーカー）の下で2時間インキュベートします。過度のインキュベーション（> 8 h）は、不透明なカバースリップを作成します。
- 低速連続回転で5分間蒸留水で2回洗浄します。
- 100％エタノールで覆わセラミックホルダーに保管してください。
- 枯草菌細胞を調製
- 適切な増殖培地5 mlに0.05と指数関数の位相（0.3から0.7のOD 600）に成長- 0.01のOD 600に希釈する。
- 水や培地中に1.25パーセントアガロースを準備します。バックグラウンド蛍光を低減する合成培地を使用しています。 ℃と72℃の加熱ブロック内店舗95℃で1.5 mlプラスチックチューブに粉を溶かす
- 二つ目のスライドのフラットパッドにスライドとプレスの中央にアガロースの小滴を追加します。少なくとも2分後、または使用する前に慎重に別々のスライド。
- 1分間12.000 rpmでマイクロ遠心機で500μlの細胞をスピンダウンする。
- 50μlの培地に上清を捨て、ペレットを再懸濁します。
- アガロースパッドの中央に2から4μlの細胞を追加します。
- 加圧された空気で乾燥したピンセットでエタノールを充填した容器からきれいにカバースリップを取ると慎重にサンプルを置きます。
- 細胞が顕微鏡の前に少なくとも2分のために解決しましょう。
- VALAP（ワセリン、ラノリン、パラフィン、熱の下で等しい重みで混合してカバースリップの端をシールし、小さなブラシで適用したり、スパッツ長期イメージングのためのULA）。
- サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞を準備する
- 前培養を希釈し、対数期（OD 600 0.2から0.8）に少なくとも5時間のための適切な培地中で成長します。
- 鉗子と加圧された空気で乾燥した容器からカバースリップを取る。
- 5μlのコンカナバリン加圧された空気ピペットと乾いたカバースリップ上に溶液（ConAで、蒸留水で2μg/ ml）を広げる。 ConAでは、酵母細胞壁の炭水化物と結合し、酵母細胞を固定化する。
- ConAでコーティングしたカバースリップの片側に4.5μlの酵母細胞懸濁液を転送します。顕微鏡スライドにカバースリップを慎重に配置します。一方のエッジで開始し、気泡の形成を避けるために徐々に落とす。
- 細胞が顕微鏡の前に少なくとも2分のために解決しましょう。
- 長期イメージングのために（上記参照）VALAPとカバースリップの端をシールします。
- 顕微鏡のセットアップ
我々は、オリンパス100倍1.45 NAの目的と完全に自動化されたIMICスタンド（フォトニクスまで）に基づいてカスタマイズされた全反射のセットアップ上のすべての実験を行った。 488 nmの（コヒーレントサファイア）で75 mWのDPSSレーザーと561 nmの（コバルトジャイブ）を光源として使用されました。レーザーは、AOTFを介して選択し、IMICへのブロードバンドファイバを介して指示された。ガルバノ駆動型2軸スキャナーヘッド（FRAP）の位置を光退色後の入射角や蛍光回復を調整するために使用されていました。追加の検流計は、落射蛍光、FRAPと全反射を切り替えるために使用された。画像は、アンドールIXON DU-897 EMCCDカメラとカメラの前で2倍の倍率のレンズで集められた。買収は、ライブの取得（フォトニクスティル）ソフトウェア·パッケージによって制御されていました。
以下の点を考慮する必要があります。- 照明光源（レーザーリットル以上プログラマブル制御伊根）と、全反射角が再現可能な結果を得るために、特に入射角は、エバネッセント波の等しい浸透を確実にするために各励起波長を調整する必要があるマルチカラー全反射のために不可欠です。我々のセットアップ全反射角度で直接ライブ集録ソフトウェアパッケージから制御される2つのガルバノメータを介して瞬時に調整することができます。
- 私達のカスタマイズされたセットアップは、さらに、全反射でトレースオブジェクトのローカライゼーションの動力学の簡単な測定を可能にする、サード検流計を介して落射蛍光、全反射とFRAPの間に急速なスイッチングを可能にします。
- 客観型全反射は、NA> 1.4の高開口数を必要とします。我々は、オリンパス100倍NA 1.45目標を使用していました。
- EMMCDカメラは対ノイズ比が高い信号のために全反射で非常によく動作します。最適な感度でイメージングを可能にするために我々は戻って16μmのピクセルサイズとEMCCDカメラを点灯512x512ピクセルを使用していました。最大解像度を維持するために、我々は2倍MAGNを配置カメラの前でificationレンズ。
- TIRFは、広視野の技術として、レーザビームの強度が広がっている。強力なレーザーは、したがって、しばしばイメージングを向上させます。我々は、75 mWのダイオードは488 nmと561 nmの固体（DPSS）レーザーを励起に使用。
- 撮影時に最適な成長条件の下で細胞を維持するために、適切な環境コントロールを使用します。我々は、酵母の温度感受性変異体を研究する（図1B）カスタムメイドの加熱室を使用していました。買収時に培地交換のために我々は、単純なフローチャンバーまたは簡単に倒立顕微鏡上に上記からアクセスすることができ、ガラス底培養皿を使用していました。
- パラメータを調整する
- 明視野照明を用いて細胞の位置を識別します。彼らは重要な写真の損傷を誘発しないように赤いLEDが特に良いです。
- の蛍光体を励起するレーザー照明に切り替え、適切なレーザーとフィルターの組み合わせを選択する選択。全反射角が臨界であることを確認してか、GFP融合タンパク質から生じる信号を検出することはできません。疑いで垂直レーザービームを得るために0°に全反射の角度を設定した場合。セルの上部（カバースリップが直面しているセルの側面）を検索します。信号が徐々に細胞表面が再表示されます（ 動画2）での蛍光点までの角度を大きくし消えるまで、レーザビームの入射角を変更します。表面での最適な位置のために再びZ-フォーカスを調整します。許容可能な全反射角がセルの端（ 図1C）全くぼやけハローを作成しません。漂白重要な写真は、セットアップ中に発生した場合、全反射の角度を保存し、集録を開始する前に漂白段の位置に移動します。
- レーザー強度とダイナミックレンジ（飽和画素をせずにノイズ比の高い信号）を最大化するためにカメラのゲインを調整します。通常はEMCCDカメラはノイズラットに高信号で非常に低い信号を検出するのに最適です。IOS。強い信号の場合、通常のCCDカメラはノイズが少なく生産し、広いダイナミックレンジを提供します。
- 全反射顕微鏡は、同じ時間（ 図1D）で撮像することができる少数の細胞で生じカバースリップの小さい高さの違い、非常に敏感です。小さな細胞の取得領域（関心領域、ROI）従って多くの場合、選択したオブジェクトを含むサブ領域に縮小することができます。これはまた、多くの場合、ハードドライブ、高フレームレートでの律速段階にチップからデータを転送するために必要な時間が短縮されます。
- ダブルカラー全反射実験のための蛍光体を介してブリードを最小限にすることを確認してください。 RFPが弱い488 nmの光（ 図2A）によって励起されているRFP / GFPのペアごとに別々の蛍光フィルターを使用しています。ほとんどのフィルタは完全に互いに整列されていません。オフセットフィルタは、細胞とに混合した蛍光ビーズを用いて補正することができます。同等の浸透深さを達成するために、foは別々に全反射角を調整するrは各レーザ線。典型的なワークフローは、 図に示されています。 2B。
- 画質に影響を与える重要なパラメータは、レーザーのアライメント、クリーンな目的である。全反射イメージングに使用されるz軸位置にレーザーは、最初にフォーカスを合わせます。その後、サンプルを削除し、すべての油の目的（残油がビームプロファイルにおけるレーザ光とスペックルの回折につながる）を清掃してください。プロジェクトTIRFモードの天井にレーザーとレーザーが目標と一直線になるように0°位置のキャリブレーション（常にレーザーの安全ゴーグルを着用し、ビームのパス内のすべての反射を避けるために、基準点を使用します）。最小限のサイズにレーザスポットの焦点を合わせる。我々のセットアップは、迅速なキャリブレーションを容易にするためにgalvosと顕微鏡との間に位置する可動レンズを提供しています。最適な調整後、レーザーのプロファイルもほぼ円形のスポットを定義して形成されなければならない。最適な画質を得るためにすべてのセッションの前にキャリブレーションを実行します。
3。代表的な結果
- 枯草菌のアクチンホモログと細胞壁分解酵素の分布は、我 々はアクチンホモログMBLまたはTIRFと定期的な落射蛍光によるトランスペPbpHのGFP融合体を発現する細胞をイメージした。 TIRFの侵入深さは明らかに減少し、カバースリップに対向する面（ 図3A、B）に制限されています。弱く発現トランスペPbpHは落射蛍光でほとんど見えないですが、明らかに全反射（ 図3B）で区別することができ皮質のパッチに局在する。縮小浸透は最高の落射蛍光の線としてではなく、全反射のドット（ 図3B、矢印 ）として表示されセプタムでPbpHGFP信号を観察することができます。
- 酵母細胞膜のタンパク質ドメイン。酵母の細胞膜蛋白質によって形成されたネットワークのようなパターンの例はすでに図に記載されています。 1Cと2。これらのネットワークのようなパターンの明確な区別を可能にする全反射の改善は対照的に加えて、微弱な信号は、しばしば全反射顕微鏡によって排他的に検出することができます。例として、我々は、Saccharomyces cerevisiae由来の TORC2複雑なコンポーネントのBit61のGFP融合をイメージした。このタンパク質は、弱く発現し、パッチ9％少ないタンパク質のコピーを持つ小さな皮質のパッチを形成する。パッチが全反射で雑音比（ 図3C）と非常に良好な信号で撮像することができますが落射蛍光のみいくつかのパッチでは、強力なバックグラウンド上に表示されます。したがって、全反射は、特に細胞表面に弱く、蛍光構造やタンパク質を研究するのに適しています。 TIRFによって提供された高軸分解能は、すでにバックグラウンド蛍光を低減します。画像のコントラストの追加の改善は、さまざまな画像処理ステップを介して取得することができます。シンプルな標準技術は、ぼやけたイメージがから減算されているローカルバックグラウンド·イコライゼーションです。オリジナル。ぼかしは、中央値またはガウスフィルタ（ 図3D）などの低域通過フィルタの様々な実行することができます。ローカルバックグラウンド減算はノイズを除去し、高強度の構造体をシャープにします。しかし、これはしばしば微細構造と高強度領域の誇張された増幅（ 図3D、矢印 ）の損失の代償。優れたプロシージャは、ImageJは、Matlabやホイヘンス（科学ボリュームイメージングBV）のような無料または市販のソフトウェアパッケージで実行することができ、2Dデコンボリューションです。 TIRF画像は非常に良好な軸方向の分解能、したがって、ほぼ2次元の点広がり関数（PSF）を提供します。我々は実験的に実験的なPSF、その後の古典的な最尤アルゴリズムでデコンボリューションのために使用された実際の画像（目的、カメラ、励起および発光波長）のために使用された同じ設定で40 nmの蛍光ビーズの画像を取得することにより、このPSFを決定ホイヘンス。時間デコンボリューション後のコントラストの増加を示してGFPRas2のかFet3GFPとPma1RFP（ 映画3と4）の動画を失効。ダブルカラー画像では、局在化値（ 動画4）を定量化することができるように、コントラストを最大にすることが重要です。
- 細胞皮質。TIRFとFRAP におけるタンパク質の代謝回転の解析は、皮質の蛋白質のダイナミクスの研究のための強力な組み合わせを提供します。しかし、これらの技術の効率的利用を可能にするために、レーザーの角度と位置の迅速な制御が必要となります。 TIRF、幅広い分野の技術では、レーザーは後焦点面に焦点を当ててする必要があり、所望の反射を達成するために、浅い入射角に従う必要があります。対照的に、FRAPは、レーザーのサンプルに直接焦点を当て、定義された構造や地域の漂白できるように、高い空間精度で位置決めする必要があります。我々が実験で用いたフォトニクスティルからセットアップが目で非常に高速かつ直感的なコントロールを提供していますESEパラメータを設定します。二ガルバノメータ制御ミラーはx、yのFRAPの位置を調整したり、全反射における入射角を設定するために使用されています。第三ミラーは全反射とFRAP照明（レーザーを全反射パスの追加レンズによって拡大されます）ごとに別々のビーム経路を切り替えるために使用されます。すべての設定がLA（ライブ集録）ソフトウェアとキャリブレーション急速に最適な条件を達成するために、各実験のために実行することができますによって制御されます。このソフトウェアはまた、運動構造のFRAP実験に不可欠な画像取得中に漂白剤の位置を定義することができます。
この機能を使用すると我々は、MBL含有パッチは観測された運動（ 図3E）のソースとしてMBLフィラメントのトレッドを除外することができます。この観察は、別の運動メカニズムのためのGoogleの検索を動機づけし、最終的に細胞内タンパク質複合体（MBLを含む）の活動を介して移動されている運動、完全に予期しないタイプの我々の同定されたセル4の外側に存在する合成酵素の細胞壁のTY。同様に、我々は全体の細胞表面（ 図3F）をカバーするネットワークのようなドメインに配布し、酵母細胞膜タンパク質の遅い再配列を観察することができました。
これらの例では、皮質の蛋白質のダイナミクスとパターン形成が直接TIRFとFRAP技術を組み合わせることによって評価する方法を示しています。
4。代表的な結果
図1。パラメータを調整する 。汚い対洗浄の共同verslip。カバースリップ上のほこりに起因するバックグラウンドシグナルは、潜在的なGFP / RFP信号と干渉し、洗浄し、カバースリップが少ないバックグラウンドを持っています。B.電気加熱コントローラは、（）プローブの温度（b）およびサンプルホルダ（c）の設定温度を表示するカスタムメイド℃ で酵母タンパク質Pma1GFPが減少入射角（下の左から右へ上から）で撮像。画像は臨界角での信号の突然の損失とノイズ比の構造情報と信号で徐々に減少を示しています。ビューのD.むらフィールド。蛍光ビーズの密な懸濁液は、ビューのフィールドの一部のみにフォーカスがあることを示し、結像される。のスケールバーは、B：Cには2μm、10μm以下。
図2。ダブルカラーイメージング。 A.は Pil1RFPのを介してブリード。 Pil1RFPが励起される488 nmと561 nmのレーザーと蛍光二重バンドパスフィルタで記録されます。 Pil1RFPの信号がGFPチャネルの弱く見えるようになります。スケールバーは2μmB.ダブルカラーイメージングを通してブリードを避けるために、一般的な手順。イメージング別のフィルタセットを持つ細胞の後、彼らは分析のためにマージされる前に、デコンボリューションと（蛍光ビーズを使用して）整列されます。
図3。代表的な結果。 BのGFPMbl分布のA.の比較TIRFまたは通常の落射蛍光（EPI）顕微鏡を用いた枯草菌 。青：明視野像から細胞境界。イメージが異なって撮像モードを使用して監視運動MreBパッチで覆われた領域を示すために、時系列の平均予測を表しています。Bの軸方向の分解能とTIRF画像のコントラストを改善しましたSはBのトランスペPbpHGFPを撮影枯草菌。矢印は、落射蛍光のリングとして、また全反射のパッチのように表示され隔染色を示しています。露光時間：S cerevisiaeにおけるTOR複合コンポーネントのBit61の落射蛍光と全反射照明の間に100ミリ秒での比較。 Bit61は非常に弱く9を発現している。露光時間：250 msの異なる画像処理方法のD.の比較。シリーズは、生の全反射Pma1GFP、ガウスまたは中央ぼかし画像の差分、のイメージだけでなく、ホイヘンスの最大尤度アルゴリズムを使用してデコンボリューションを示す単一のGFPMblパッチのE. TIRF-FRAP（アスタリスク上）B.を越えて移動枯草菌細胞。モーションのソースとしてトレッド外の非回復パッチとキモグラフに沿った強度プロファイル（点線）はルールのキモグラフ。F. TIRF-FRAP Pma1GFPを発現する酵母細胞の。の拡散を閉じることに注意してください皮質の染色パターンのギャップ。スケールバー：2μmである。時間（秒単位）。
ムービー1。B. を示すムービー枯草菌細胞は汚れたカバースリップ上のRFP融合タンパク質を発現する。 RFP信号が背景雑音からほとんど区別できないことに注意してください。サイクルタイムは100ms。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
映画2。異なる入射角でPma1GFPのムービー。信号が失われるまでの角度は、亜臨界から臨界角に変更されます。ノートでは、臨界角の内部信号で臨界角でPMにだけタンパク質が表示されるまで騒々しい画像を引き起こして、表示されます。サイクルタイム200ミリ秒。スケールバー：2μmである。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
酵母GFPRas2の映画（3）映画、alternatを示するRAWとデコンボリューションTIRF画像。 GFPRas2が高速移動するタンパク質（2S未発表データのT1 / 2）で、高速アクイジション時間は、動的な振る舞いを解決するために重要である。サイクルタイム150ミリ秒。スケールバー：2μmである。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
ムービー4。酵母タンパク質Fet3GFPとPma1RFPのダブルカラー映画。最初の10フレームは、RAW画像を表し、最後のフレームはデコンボリューションされています。この映画は、局在解析のための画像処理の重要性を示しています。ぼやけたRAW画像は、解析が可能となり、シャープになります。サイクルタイム5秒。スケールバー：2μmである。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
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Discussion
全反射顕微鏡は、画像周辺のタンパク質への選択のテクニックです。エバネッセント場の低浸透深さは、対雑音比が非常に良好なシグナルにつながり、高いフレームレート、または非常に弱く発現したタンパク質のイメージングとデータ収集を可能にするフォーカスライトのうち最小限に抑えることができます。高コントラスト、高フレームレートの組み合わせは、全反射顕微鏡皮質ローカライズされたタンパク質のイメージングの時空間ダイナミクスの最適なツールとなっています。興味深いことに多くの微生物を囲む厚い細胞壁は全反射によって末梢タンパク質のイメージングを妨げることはありません。実際には、一過性の実際の生成は非常に高い細胞壁と原形質膜5,10との間のインタフェースで発生します。終了した細胞でも酵母細胞8に撮像することができ、大きな表面積を説明するかもしれない細胞壁に沿って光の伝播につながる可能性がある光の反射。
TIRF IMの最適な品質のために年齢にもキャリブレーション顕微鏡システムを持つことが重要です。レーザーは、各イメージングセッションの前に集中して調整する必要があります。カバーガラスの清掃（ 図1A）と、細胞が適切に固定化されなければならない必要があります。ダブルカラーイメージング分光ブリードスルーは考慮されたり、フィルターセットフィルター、個別の放射範囲を使用することによって除去する必要があります。これは明らかに機械的なフィルターの変化に起因する遅い買収倍の価格で来る。必要に応じて、高速フィルタホイールやガルバノ駆動照明源は、この遅延を回避できます。また、重要なフルオロフォア（RFP）は、信号干渉のレベルを最小限に抑えるために、ペアの弱い発現したタンパク質を使用することができます。
ハイコントラストのにもかかわらず、全反射顕微鏡で撮影した画像は、大きなノイズが含まれています。このノイズを除去し、さらに向上させる画像のコントラストの画像は、さまざまなフィルタリングの手順で処理することができます。私たちの最高の結果を持つメソッド経験は、2Dデコンボリューションです。これは、各サンプルと顕微鏡条件のPSFの測定実験を必要とします。しかし、これはそれぞれのサンプルに混入した蛍光ビーズを用いて簡単かつ迅速にかなり行うことができます。二色実験のためにこれらのビーズは、さらにチャネルの整列に使用することができます。
我々は、微生物の皮質のタンパク質のイメージングのための全反射顕微鏡を使用することの利点を実証した。 TIRFと画像処理の組み合わせは、高いフレームレート（<50 ms）とコントラストを持つ画像の取得を可能とし、また、Bit61ように弱く発現したタンパク質の可視化を可能にします。微生物の全反射イメージングを実行する追加の利点は、これらの細胞の膨圧がフラット細胞膜につながり、全反射信号に位相的な影響を最小限に抑えます。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、マックス·プランク協会によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
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