Summary

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

Published: May 01, 2012
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Summary

全内部反射蛍光(全反射)顕微鏡は、高コントラスト分解能と時間分解能で細胞表面に近い構造を観察するための強力なアプローチです。我々は、全反射は、細胞壁で囲まれた細菌や真菌細胞の皮質でのタンパク質のダイナミクスを研究するために用いることができる方法を示しています。

Abstract

全反射顕微鏡は、in vitroで、細胞1を生体内蛍光分子の時空間ダイナミクスを研究するための強力なイメージング技術として浮上してきました。特性臨界角(に近い境界と平行であることにIE)よりも大きい角度で低屈折率と培地中に高屈折率媒質から通過するとき光全反射の光学現象が発生します。すべての光がそのような条件下で反射されていますが、エバネッセント波は距離とともに指数関数的に減衰し、唯一のインターフェイス2の近くに100から200 nmであるサンプル領域を貫通して境界を越えてとに沿って伝播し、作成されます。優れた軸方向の分解能を提供することに加えて、焦点蛍光体のうちの低下励起対雑音比が非常に高い信号を生成し、2,3退色の有害な影響を最小限に抑えます。広視野のテクニックなので、全反射も高速な画像交流できます。ほとんどのスキャンベースの共焦点顕微鏡のセットアップよりquisition。

一見すると、全反射の低浸透深さは、多くの場合、厚い細胞壁で囲まれている細菌および真菌細胞のイメージングと互換性がないと思われる。それどころか、我々は酵母や細菌の細胞の細胞壁は、実際に全反射の使いやすさを向上させ、観察可能な構造を4-8の範囲を広げることを発見した。多くの細胞プロセスは、したがって、直接、しばしば強力な遺伝子操作技術を提供する小さな、単一細胞微生物で全反射によってアクセスすることができます。これは、私たちはタンパク質相互作用や活動の動態を直接生きた細胞で評価することができるin vivoで生化学の実験行うことができます。

ここではサッカロミセス·セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)または枯草菌細胞ため高品質の全反射画像を得るために必要な個々の手順について説明します。我々はaffeできる様々な問題点を指摘CT TIRFは、細胞内蛍光プローブの可視化といくつかのアプリケーション例と手順を示しています。最後に、全反射画像がさらに確立された画像復元技術を使用して改善することができる方法を示しています。

Protocol

1。試料調製カバースリップの準備 TIRFは、カバースリップ( 図1A、映画1)に起因するバックグラウンドシグナルに敏感であるとして、カバーガラスは、ダスト粒子からきれいにする必要があります。 蓋付きセラミックホルダーに鉗子場所カバースリップを使用します。 1 MのNaOH(複数回再利用することができます)でガラス容器を埋める。 <…

Discussion

全反射顕微鏡は、画像周辺のタンパク質への選択のテクニックです。エバネッセント場の低浸透深さは、対雑音比が非常に良好なシグナルにつながり、高いフレームレート、または非常に弱く発現したタンパク質のイメージングとデータ収集を可能にするフォーカスライトのうち最小限に抑えることができます。高コントラスト、高フレームレートの組み合わせは、全反射顕微鏡皮質ローカ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、マックス·プランク協会によって資金を供給された。

Materials

Name of the tool/reagent Type Company Catalogue number
Orbital Shaker Tool UniEquip UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER
TIRF microscope Till   Customized setup
Glass container Tool Vitlab 340-232880353
Ceramic staining rack Tool Thomas Sci. 8542E40
Concanavalin A Reagent Sigma L7647
Coverslips #1(18 x 18 mm) Microscope Menzel Gläser BB018018A1
Microscope Slides Microscope Menzel Gläser AA00000102E
Immersion Oil Microscope Zeiss Immersol 518F
Agarose Reagent Invitrogen 16500-500
FluoSpheres Reagent Invitrogen F8795

References

  1. Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
  2. Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
  3. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
  4. Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
  5. Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
  6. Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
  7. Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
  8. Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
  9. Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
  10. Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).

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Cite This Article
Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Müller, N., Wedlich-Söldner, R. Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (63), e3982, doi:10.3791/3982 (2012).

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