In vitro Elektroporation af Nedre rhombisk Lip af Midgestation museembryoer
Summary
Denne undersøgelse beskriver udviklingen af en<em> In vitro</em> Elektroporering teknik, som muliggør manipulation af genekspression i den nedre rombisk læbe midgestation embryoer.
Abstract
Den rombiske læbe er en embryonisk neuroepitel placeret i baghjerne ved forbindelsen mellem neuralrøret og roofplate af den fjerde ventrikel (gennemgået i 1). Den rombiske læbe kan inddeles i den øvre rombisk læbe (URL), der omfatter rhombomere 1 (R1) og genererer neuroner i cerebellum og det nedre rombisk læbe (LRL), hvilket giver anledning til forskellige neuronale hjernestamme linier 2-4. LRL derivater omfatter de auditive neuroner i den cochleare kerner og de i precerebellar kerner, der er involveret i reguleringen af balance og motorisk kontrol 5-8. Neurogenese fra LRL sker over et stort tidsmæssig vindue, omfatter embryoniske dag (E) 9,5 til 16,5 5, 9. Forskellige neuronale slægter komme fra LRL som postmitotiske celler (eller er født) under forskellige udviklingsmæssige dage i løbet af denne neurogen vindue.
Elektroporering af genekspression konstrukter kan anvendes tilmanipulere genekspression i LRL stamfædre og kan potentielt ændre skæbnen for de neuroner fremstillet af denne region 10-12. Ændring genekspression af LRL stamfædre i musen via in utero elektroporation har været meget vellykket for at manipulere slægter født på fosterdag E12.5 eller senere 10, 12-14. In utero elektroporeringer forud for E12.5 har tabt sagen primært som følge af dødelighed i forbindelse med punktering den fjerde ventrikel roofplate, et nødvendigt skridt i at levere eksogene DNA, der er elektroporeres ind LRL. Imidlertid mange LRL afledt slægter skyldes LRL før E12.5 9. Disse tidligere født slægter indbefatter neuroner, der omfatter laterale retikulære, ekstern cuneate og ringere olivary kerner af precerebellar system, som fungerer til at forbinde input fra rygmarven og cortex af cerebellum 5. For at manipulere ekspression i LRLembryoner yngre end E12.5, udviklede vi en in vitro system, hvor embryoer anbragt i kultur efter elektroporering.
Denne undersøgelse viser en effektiv fremgangsmåde til manipulering af genekspression af LRL progenitorer ved E11.5. Embryoer elektroporeret med grønt fluorescerende protein (GFP) drevet fra bredt aktive CAG promotor reproducerbart udtrykt GFP efter 24 timers dyrkning. Et kritisk aspekt af dette assay er, at genekspression kun ændres på grund af ekspressionen af det eksogene gen og ikke på grund af sekundære virkninger, som skyldes elektroporering og dyrkningsteknikker. Det blev fastslået, at de endogene genekspressionsmønstre forblive uforstyrret i elektroporerede og dyrkes embryoner. Dette assay kan anvendes til at ændre skæbne af celler, der følger LRL af embryoner yngre end E12.5 ved indførelse af plasmider til overekspression eller vælte (gennem RNAi) af forskellige pro-neurale transkriptionsfaktorer.
Protocol
Discussion
In vitro elektroporering teknik i denne undersøgelse, er en hidtil ukendt metode, der effektivt kan anvendes til at manipulere genekspression i embryoer yngre end 12 dages drægtighed. Placering af embryoer i kultur tillader ekspression af det indførte gen, og omgår den letalitet observeret når elektroporerede embryoner lov til at forblive in vivo. Denne teknik giver mulighed for manipulation af genekspression i embryoniske stamceller, der tidligere var utilgængelige for elektroporation-baserede u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Jane Johnson for Math1, Ngn1, og Ptf1a antistoffer og Connie Cepko for pCAG :: GFP plasmid. Dette arbejde blev finansieret af NIH R15 1R15HD059922-01.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux — toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
