In vitro Elektroporatie van de Tweede Rhombic Lip van Midgestation muizenembryo's
Summary
Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een<em> In vitro</em> Electroporatie techniek die het mogelijk maakt voor de manipulatie van genexpressie in de onderste lip van ruitvormige midgestation embryo's.
Abstract
De ruitvormige lip is een embryonale neuroepithelium in de achterhersenen op het knooppunt tussen de neurale buis en het dak zelf van het vierde ventrikel (beoordeeld in 1). De ruitvormige lip kan worden onderverdeeld in de bovenste ruitvormige lip (URL), die rhombomere 1 (R1) omvat en genereert neuronen van het cerebellum en de onderste ruitvormige lip (LRL) die aanleiding geeft tot diverse neuronale hersenstam lijnen 2-4. LRL derivaten omvatten de auditieve neuronen van de slakkenhuis kernen en die van de precerebellar kernen die betrokken zijn bij de regulering evenwicht motorbesturing 5-8. Neurogenese van de LRL optreedt over een grote tijdelijke venster dat embryonale dagen (E) 9.5-16.5 5, 9 omvat. Verschillende neuronale lijnen komen uit de LRL als postmitotische cellen (of zijn geboren) in verschillende ontwikkelings-dagen tijdens deze neurogene venster.
Elektroporatie van genexpressie constructen kunnen worden gebruiktmanipuleren genexpressie in LRL voorlopers en kan mogelijk veranderen het lot van de neuronen uit deze regio 10-12. Het veranderen van genexpressie van LRL voorlopercellen in de muis via de in de baarmoeder elektroporatie is zeer succesvol gebleken voor het manipuleren van lineages geboren op embryonale dag E12.5 of later 10, 12-14. In utero electroporations voorafgaand aan E12.5 zijn vooral succesvol vanwege de letaliteit geassocieerd met aanprikken van de vierde ventrikel dak zelf, een noodzakelijke stap in het leveren van exogene DNA dat wordt geëlektroporeerd in de LRL. Echter, veel LRL afgeleid lijnen komen voort uit de LRL eerder dan E12.5 9. Deze eerder geboren lijnen zijn de neuronen die de laterale reticulaire omvatten, externe cuneate, en inferieure olivaris kernen van de precerebellar systeem met als functie het input van het ruggenmerg en de hersenschors verbinden met de kleine hersenen 5. Om uitdrukking in de LRL te manipulerenvan embryo's jonger dan E12.5, ontwikkelden we een in vitro systeem waarin embryo's worden in de cultuur geplaatst na elektroporatie.
Deze studie geeft een efficiënte en effectieve methode voor het manipuleren van de genexpressie van LRL voorlopercellen op E11.5. Embryo's geëlektroporeerd met groen fluorescerend eiwit (GFP) verdreven uit de over het algemeen actieve CAG promotor reproduceerbaar uitgedrukt GFP na 24 uur van de cultuur. Een cruciaal aspect van deze test is dat de genexpressie wordt alleen gewijzigd als gevolg van de expressie van het exogene gen en niet omwille van secundaire effecten die het gevolg zijn van de elektroporatie en het kweken technieken. Er werd vastgesteld dat de endogene genexpressie patronen ongestoord blijft geëlektroporeerde en gekweekte embryo's. Deze test kan worden gebruikt om het lot van cellen die uit de LRL van embryo's jonger dan E12.5 door de introductie van plasmiden voor overexpressie te wijzigen of knock down (door middel van RNAi) van verschillende pro-neurale transcriptiefactoren.
Protocol
Discussion
De in vitro elektroporatie techniek die in deze studie is een nieuwe methodiek die efficiënt kan worden om de genexpressie te manipuleren gebruikt in embryo's jonger dan 12 dagen van de dracht. Plaatsing van de embryo's in de cultuur maakt de expressie van het geïntroduceerde gen zijn en is de letaliteit waargenomen wanneer geëlektroporeerde embryo's mogen blijven in vivo. Deze techniek maakt het mogelijk om manipulatie van genexpressie in embryonale voorlopers die voorheen niet toeganke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Jane Johnson bedanken voor de Math1, Ngn1 en Ptf1a antilichamen en Connie Cepko voor de pCAG :: GFP plasmide. Dit werk werd gefinancierd door NIH R15 1R15HD059922-01.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux — toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
