Summary

Em Eletroporação vitro do lábio inferior rômbico de embriões de camundongos Midgestation

Published: August 03, 2012
doi:

Summary

Este estudo descreve o desenvolvimento de um<em> In vitro</em> Técnica de electroporação que permite a manipulação da expressão do gene no lábio inferior rômbico de embriões midgestation.

Abstract

O lábio rômbico é um neuroepitélio embrionário localizado no cérebro posterior na junção entre o tubo neural eo roofplate do quarto ventrículo (revisto em 1). O lábio rômbico pode ser subdividido no lábio superior rômbica (URL), que engloba rhombomere 1 (R1) e gera os neurónios do cerebelo eo lábio inferior rômbica (MID), que dá origem a diversas linhagens de tronco cerebral neuronais 2-4. Derivados LRL incluem os neurónios auditivos dos núcleos coclear e aqueles dos núcleos precerebellar que estão envolvidos na regulação do motor e do equilíbrio de controlo 5-8. Neurogênese a partir do LRL ocorre ao longo de uma grande janela temporal que engloba dias embrionários (E) 9,5-16,5 5, 9. Diferentes linhagens neuronais emergir do LRL como células pós-mitóticas (ou nascem) durante diferentes dias de desenvolvimento durante esta janela neurogênica.

Electroporação de construções de expressão de genes pode ser usado paramanipular a expressão do gene em células progenitoras LRL e potencialmente pode mudar o destino dos neurônios produzidos a partir desta região 10-12. Alterando a expressão gênica de células progenitoras LRL no rato através de eletroporação in utero tem sido muito bem sucedida para a manipulação de linhagens nascidos no dia embrionário E12.5 ou mais tarde, 10, 12-14. Em electroporações útero antes E12.5 não tiveram sucesso devido principalmente à letalidade associada a punção da roofplate quarto ventrículo, um passo necessário na entrega de DNA exógeno que é electroporados para o MID. No entanto, muitos LRL linhagens derivadas surgem a partir do LRL mais cedo do que E12.5 9. Estas linhagens anteriormente nascidos incluem os neurónios que compõem a reticular lateral, cuneate externo, e os núcleos olivar inferior do sistema de precerebellar que funcionam de modo a ligar as entradas a partir da medula espinal e do córtex para o cerebelo 5. A fim de manipular expressão na LRLde embriões com menos de E12.5, desenvolvemos um sistema in vitro em que os embriões são colocados em cultura na sequência de electroporação.

Este estudo apresenta um método eficiente e eficaz para manipular a expressão de genes dos progenitores LRL em E11.5. Embriões electroporado com a proteína verde fluorescente (GFP) accionada a partir do promotor CAG amplamente activa reprodutivelmente expressa GFP após 24 horas de cultura. Um aspecto crítico da presente ensaio é que a expressão do gene só podem ser alterados por causa da expressão do gene exógeno e não por causa de efeitos secundários que resultam da electroporação e técnicas de cultura. Foi determinado que os padrões de expressão de genes endógenos permanecer intacta em embriões eletroporados e culta. Este ensaio pode ser utilizado para alterar o destino das células que emergem do LRL de embriões com menos de E12.5 através da introdução de plasmídeos para a superexpressão ou derrubar (através RNAi) de diferentes pró-neurais fatores de transcrição.

Protocol

1. Preparativos Antes da Eletroporação Amplificar o DNA de eletroporação por uma preparação maxi (Prime-It ou Qiagen). A concentração do ADN deve ser no mínimo de 1 mg / mL para a absorção eficiente. Remover 495 uL de ADN e de mistura com 5 ul de 0,01% Verde Rápido em 1 X PBS (solução salina tamponada com fosfato) num tubo de microcentrífuga. 2. Colheita embrionário Estabelecer acasalamentos programados de CD-1 camundongos (Harlan). Verif…

Discussion

A técnica in vitro electroporação apresentado neste estudo é uma nova metodologia que pode ser utilizada de forma eficiente para manipular a expressão do gene em embriões de menos de 12 dias de gestação. Colocação dos embriões em cultura permite a expressão do gene introduzido e contorna a letalidade observada quando embriões eletroporados for permitido permanecer in vivo. Esta técnica permite a manipulação da expressão gênica em células progenitoras embrionárias que anteri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Jane Johnson para o Math1, Ngn1 e anticorpos Ptf1a e Connie Cepko para o pCAG :: GFP plasmídeo. Este trabalho foi financiado pelo NIH R15 1R15HD059922-01.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Cryostat Leica CM-1850  
Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps Fine Scientific Tools 11252-30  
20 mm MORIA perforated spoon Fine Scientific Tools 10370-17  
ECM 830 Square Wave Electroporation Generator BTX (VWR) 47745-928  
Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes BTX (Fisher) BTX450165  
Fisher Isotemp CO2 Incubator Fisher 1325525  
NAPCO CO2 Gas Regulator Fisher 15497020  
12 Well Tissue Culture Plates BD Falcon (Fisher) 877229  
HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL Thermo Scientific (Fisher) SH3002301  
HyClone* Donor Equine Serum Thermo Scientific (Fisher) SH3007402  
Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated Invitrogen 16140-063  
cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin Mediatech (Fisher) MT-30-002-CI  
HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl Thermo Scientific (Fisher) SH3003401  
Fast-Green Fisher AC41053-0250 0.01%

References

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Cite This Article
Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T., Landsberg, R. L. In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (66), e3983, doi:10.3791/3983 (2012).

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