Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında
Summary
Bu çalışma, bir gelişmesi açıklar<em> In vitro</emMidgestation embriyoların eşkenar alt dudakta gen manipülasyonu için izin> elektroporasyon tekniği.
Abstract
Eşkenar dudak nöral tüp ve dördüncü ventrikül (1 Yorumlar) ile roofplate arasındaki kavşakta arka beyin bulunan bir embriyonik neuroepithelium olduğunu. Eşkenar dudak rhombomere 1 (R1) kapsar ve beyincik nöronlar ve çeşitli nöronal beyin soy 2-4 sebebiyet veren alt eşkenar dudak (LRL) oluşturduğu eşkenar üst dudak (URL) bölünmüştür edilebilir. LRL türevleri işitsel koklear çekirdeklerin nöronlar ve denge ve motor kontrol 5-8 düzenleyen katılan precerebellar çekirdeklerin olanları içerir. LRL gelen nörogenez embriyonik gün (E) 9,5-16,5 5, 9 kapsayan geniş bir zamansal pencere içinde oluşur. Farklı nöronal soy bu nörojenik penceresi sırasında farklı gelişimsel gün boyunca postmitotik hücreleri (veya doğar) gibi LRL çıkarlar.
Gen ifadesi yapıları elektroporasyon için kullanılabilirLRL ataları gen ekspresyonu işlemek ve potansiyel olarak bu bölgede 10-12 üretilen nöronların kaderini değiştirebilirsiniz. Utero elektroporasyon yılında aracılığıyla fare LRL progenitörlerin değiştirilmesi gen ekspresyonu embriyonik gün E12.5 veya daha sonra 10, 12-14 doğumlu soy işlenmesi için oldukça başarılı olmuştur. Utero electroporations yılında öncesinde E12.5 öncelikle nedeniyle başarısız olmuştur ölümcül dördüncü ventrikül roofplate, LRL içine electroporated olan eksojen DNA sağlanmasında gerekli bir adım delinme ile ilişkilidir. Ancak, birçok LRL edilen soyların önceki E12.5 9'dan LRL kaynaklanmaktadır. Bunlar daha önce doğan soy lateral retiküler oluşturan nöronlar, dış cuneate ve beyincik 5 omurilik ve korteks girişleri bağlamak için işlev precerebellar sisteminin alt olivary çekirdekleri içerir. LRL ifade işlemek amacıylaE12.5 daha genç embriyo, bu embriyosu elektroporasyon takiben kültürü içine yerleştirilmiş olduğu bir in vitro sistemi geliştirilmiştir.
Bu çalışma E11.5 az LRL progenitörlerin gen ifadesini değiştirmek için etkin ve verimli bir yöntem sunar. Genel olarak aktif CAG organizatörü sürüldü yeşil floresan protein (GFP) ile electroporated embriyolar tekrarlanabilir kültür 24 saat sonra GFP dile getirdi. Bu testin kritik bir yönü olduğunu gen ekspresyonu çünkü sadece eksojen geninin ifade değil, çünkü ikincil etkiler değiştirilmiş olmasıdır elektroporasyon ve kültür teknikleri sonucu bu. Bu endojen gen ekspresyonu electroporated ve kültürlü embriyolarda bozulmadan kalır olduğu tespit edilmiştir. Bu test için aşırı plazmidlerin tanıtım yoluyla E12.5 daha genç embriyoların LRL çıkan hücrelerin kaderini değiştirebilir veya (RNAi yoluyla) yıkmak için kullanılabilecek farklı pro-nöral transkripsiyon faktörleri.
Protocol
Discussion
Bu çalışmada sunulan vitro elektroporasyon tekniği verimli gebeliğin 12. günden küçük embriyolarda gen ekspresyonu işlemek için kullanılabilir yeni bir yöntemdir. Kültürüne embriyoların Yerleştirme tanıttı gen ekspresyonu izin verir ve electroporated embriyolar in vivo olarak kalmasına izin verildiğinde öldürücü gözlenen circumvents. Bu teknik elektroporasyon tabanlı çalışmalar için daha önce ulaşılamayan embriyonik ataları gen ifadeleri değişiklik yapıla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Math1, Ngn1 Jane Johnson teşekkür ve Ptf1a antikorlar ve pCAG için Connie Cepko :: GFP plazmid olacaktır. Bu çalışma NIH R15 1R15HD059922-01 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux — toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
