In vitro Elektroporering av Nedre rombisk läpp embryon Midgestation Mus
Summary
Denna studie beskriver utvecklingen av en<em> In vitro</em> Elektroporering teknik som möjliggör manipulering av genuttryck i det nedre rombisk läpp midgestation embryon.
Abstract
Den rombiska läppen är en embryonal neuroepitelet belägen i bakhjäman vid förbindelsen mellan den neurala röret och roofplate av den fjärde ventrikeln (översikt i 1). Den rombiska läppen kan delas in i den övre rombisk läppen (URL) som omfattar rhombomere 1 (R1) och genererar nervceller i lillhjärnan och den lägre rombisk läppen (LRL) som ger upphov till olika neuronala hjärnstammen linjer 2-4. LRL derivat innefattar de auditiva neuroner i det kokleära kärnan och de i precerebellar kärnor som är involverade i reglering av balansen och motorstyrningen 5-8. Neurogenes från LRL sker över ett stort tidsmässigt fönster som omfattar embryonala dagar (E) från 9,5 till 16,5 5, 9. Olika neuronala celltyper ur den LRL som postmitotiska celler (eller födda) under olika utvecklingsstadier dagar under den här neurogen fönster.
Elektroporering av konstruktioner genuttryck kan användas för attmanipulera genuttryck i LRL föregångare och kan möjligen förändra ödet för de nervceller som framställs från denna region 10-12. Ändra genuttrycket av LRL föregångare i musen via in utero elektroporation har varit mycket framgångsrik för att manipulera linjer födda embryonala dag E12.5 eller senare 10, 12-14. I livmodern elektroporeringar före E12.5 har misslyckats främst på grund av dödlighet i samband med punktering av fjärde ventrikeln roofplate, ett nödvändigt steg att leverera exogent DNA som är elektroporeras i LRL. Men många LRL härrör linjer uppstår vid LRL tidigare än E12.5 9. Dessa tidigare födda härstamningar innefattar neuroner som innefattar den laterala retikulära, extern KILFORMIG och underlägsen olivary kärnor av precerebellar system som fungerar för att ansluta ingångarna från ryggmärgen och cortex till cerebellum 5. För att manipulera expression i LRLav embryon yngre än E12.5, utvecklade vi en in vitro-system där embryon placeras i kultur efter elektroporation.
Denna studie presenterar en effektiv metod för att manipulera genuttrycket av LRL föregångare på E11.5. Embryon elektroporerade med grönt fluorescerande protein (GFP) drivs från i stort sett aktiva CAG promotor uttryckt reproducerbart GFP efter 24 timmars kultur. En kritisk aspekt av denna analys är att genuttryck endast påverkas på grund av uttrycket av den exogena genen och inte på grund av sekundära effekter som resulterar från elektroporering och tekniker odling. Det bestämdes att de endogena genuttryck mönster kvar ostört i elektroporerade och odlade embryon. Denna analys kan användas för att förändra öde celler som kommer ut från LRL av embryon yngre än E12.5 genom införande av plasmider för överuttryck eller riva (genom RNAi) av olika pro-neurala transkriptionsfaktorer.
Protocol
Discussion
In vitro elektroporation teknik som presenteras i denna studie är en ny metodik som effektivt kan användas för att manipulera genuttryck i embryon yngre än 12 dagar av dräktigheten. Placering av embryona i kultur tillåter expression av den införda genen och kringgår letalitet observeras när elektroporerade embryon tillåts stanna kvar in vivo. Denna teknik möjliggör manipulering av genuttryck i embryonala stamceller som tidigare otillgängliga för elektroporering-baserade studier.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Jane Johnson för Math1, Ngn1 och Ptf1a antikroppar och Connie Cepko för pCAG :: GFP-plasmid. Detta arbete har finansierats av NIH R15 1R15HD059922-01.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux — toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
