Summary
Микробные эукариот являются источником фотосинтеза производные углерода и топ хищных видов в постоянно покрытых льдом озер Антарктиды. В настоящем докладе описывается подход обогащение культуры, чтобы изолировать метаболически универсальный эукариот микробных из Антарктики озера, озера Бонни, и оценивает потенциал неорганических фиксации углерода помощью радиоизотопного анализа для рибулозо-1 ,5-bisphophate карбоксилазы оксигеназы (RUBISCO) деятельности.
Protocol
1. Примеры приобретения
- Выбрать и подготовить отбора проб за один день до отбора проб в толще воды. Это позволит стратифицированных слоях водной толщи по реформированию после нарушения в связи с бурением и прорубь плавления. Определить местонахождение буровых сайте GPS.
- Чтобы получить доступ к толще воды, можно приступить к бурению отверстий под лед с шнека Jiffy льда, скрепленная с 4-дюймовым Jiffy продление полета и резка немного. Для предотвращения замерзания сверла в отверстие, старайтесь избегать бурения в жидкой воды путем прекращения бурения примерно 4-6 см выше верхней толщи воды.
- Отверстия должны быть расширены с диаметром от 15 до 60 см до отбора проб. Это достигается за счет использования отверстия плавильной (Hotsy Model), которая циркулирует подогревом полиэтиленгликоля через медную трубу. Отверстие плавления обычно занимает до 18 часов.
- До отбора проб водного столба, убедитесь, что все необходимое оборудование и образцы йOrage суда собрались в отбора проб. Выборка материалы включают в себя: Niskin бутылку (5-10 мощность L), лебедка с глубины калиброванный кабель, Messenger, достаточный бутылки образец для каждой выборки глубина и охладители для образца транспорта.
- Начало отбора проб в начале дня (~ 5 часов), как фильтрация воды озера должна быть завершена в день отбора проб. Сбор проб воды (1-5 л) от желаемой глубины (в этом исследовании: 6-м, 15-м и 18-м глубины отбора проб, измеренной от пьезометрический уровня воды в проруби), используя Niskin образец прилагается к калиброванный ручной лебедки. Для предотвращения нарушений водного столба собрать небольшой глубине до более глубоким.
- Магазин озера образцы в холодильниках и транспорта из образца сайта в поле лаборатории, используя сани, прикрепленной к ATV (All Terrain транспортного средства). Образцы должны быть обработаны или стабилизируется (например, для: флэш-замораживание жидким азотом) в полевой лаборатории сразу же после отбора проб.
2. DevelopmeП накопительных культур
- Для выращивания обогащения культур, Концентрат 0,5-1 л воды в озере на 47 мм 0,45 мкм Размер пор фильтра полиэфирсульфона помощью нежных фильтрации (<0,3 атм). Если разнообразие природного сообщества желании фильтровать второго образца на 47 мм 0,45 мкм Размер пор фильтра полиэфирсульфона и последующих протоколов в соответствии с Bielewicz и др. 4. Разнообразия эукариот филогенетическое.
- Передача фильтра 50 мл стерильной пробирке сокол, содержащей ~ 20 мл фильтрованной воды озера собраны из той же глубине выборки в качестве фильтра. Осторожно промыть клетки фильтр, используя стерильные пипетки.
- Передача суспензии клеток на 25 см 2 стерильной колбе культуре клеток. Добавить фильтруется озеро вод, собранных с каждого образца глубина повышение культуры объеме 45 мл. Настройка нескольких репликацию для каждой выборки, если глубина обогащения на различных носителях культуры лучшего.
- Дополнение культуры фляги с 50X сterile решения конечной концентрации 1х из следующих питательных сред: базальной среды Болда, BG11 и F / 2. Если выращивание миксотрофных организмов требуется, установка до двух F/2-supplemented суда и добавить 2-3 зернами риса стерильной одной из колб.
- Инкубируйте культуру колбах при низкой температуре (4 ° С) и низкой освещенности (20 мкмоль квантов м -2 с -1) в контролируемой температурой роста инкубаторе в течение 4 недель в Антарктиде до отправки в вашей лаборатории США. Если изоляты желании пластины 250 мкл обогащения культуры на агаре чашки, содержащие соответствующие средства массовой информации рост через 2 недели инкубации.
- Для отправки в США, передачи обогащению культур в стерильные 50 мл сокол труб. Запрос отгрузки требование "не замерзают" и "сохранять хладнокровие" на доставку запроса. В то время как процесс доставки из Антарктиды сравнительно быстро (за 2 недели коммерческие воздуха) и высокой надежностью, есть возможность потери привередливый организмы в транспортном процессе. Таким образом, исследователи могут хотите сохранить подвыборки перед отгрузкой, так что потеря некоторых видов в процессе доставки могут быть оценены.
- По прибытии в США, передача 5 мл обогащению культуры в 45 мл соответствующей питательной среды в 125 мл стерильной колбе Эрленмейера покрытый стерильной губкой. Обогащение культуры должны быть сохранены как стоял культур в контролируемой температурой экологические камеры роста (суточные палаты роста, VWR) при 4 ° C/20 мкмоль квантов м -2 с -1. Культура должна быть переведена на свежем СМИ каждые 30 дней.
3. Клеточный лизат Извлечение из отфильтрованных обогащения
- Фильтр 5 мл обогащению культуры на 25 мм Whatman GF / F фильтр, используя нежные вакууме (<10 фунтов на квадратный дюйм). Фильтр может быть сохранен в течение нескольких недель при температуре -80 ° C до опробования RUBISCO деятельности.
- Вырезать фильтр в разделах 4-5 стерильными ножницами стали ипередача части стерильным пинцетом 2 мл трубы колпачок заполнить одну пятую часть полного пути с диаметром 0,1 мм циркония / диоксид кремния бисера.
- Добавить 1,25 мл буфера для экстракции фильтр (50 мМ бицин, 10 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 5 мг / мл BSA и 0,1% тритона Х-100, добавить свежие: 10 мМ NaHCO 3, 10 мМ ДТТ, 3,3 мм аминокапроновая кислоты, 0,7 мм benzamidine, рН 7.8) 13 и нарушить клетки, используя Minibead било три раза за 30 лет на скорость настройки 48. Для предотвращения нагрева образца, альтернативные beadbeating с 1 инкубации лед мин.
- Центрифуга фильтр раствор в течение 2 мин при 3000 мкг при 4 ° С с образованием свободных гранул из GF / F фильтров волокна и мусор клеточной стенки.
- Удалить 200 мкл и погружают в 800 мкл ледяной 90% ацетон. Измерьте извлекаемые хлорофилла (Хл) в спектрофотометре при длине волны значения 664 нм и 647 нм 14. Перенести супернатант в 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
- Центрифуга remainiнг супернатант при 4 ° С в течение 2 мин при 15000 х г и перенести супернатант (избежать осадок нерастворимого клеточных мембран и остальных GF / F фильтров волокна) на чистую трубку микроцентрифужных 1,5 мл. Это растворимый лизат клеток могут теперь быть использованы в деятельности Анализ карбоксилазы RUBISCO.
- Лизата может храниться при -80 ° С после добавления 12,5% глицерина и флэш замораживание в жидком азоте. Потеря активности может произойти после нескольких циклов замораживания / оттаивания, в зависимости от чувствительности ферментов в лизат. Таким образом, активность по сравнению с замороженной свежей лизат должны быть проверены до крупномасштабных Клеточный лизат экстракции.
4. RUBISCO карбоксилазы Анализ активности фильтра
- Передача 125 мкл растворимый лизат в 15 мл колпачок микроцентрифужных трубке (крышка не требуется), который был охлажденным на льду. Для отрицательных контрольных образцов, добавить 125 мкл растворимый лизат 15 мл винт трубы микроцентрифужных шапку, но не добавляют субстрат (в пункте 4.7). Работатьдублировать реакции для всех образцов и отрицательного контроля.
- Подготовить 10 мл буфером свежие (50 мМ бицин-NaOH, рН 8,0, 50 мМ NaHCO 3, 25 мМ MgCl 2), и холод на льду. Алиготе достаточно буфером для всех образцов и отрицательных контролей (100 мкл на пробу / управления, плюс дополнительно 100 мкл) в 5 мл трубку. Выполнить все последующие шаги под тягой.
- Добавить 40 мкл NaH 14 CO 3 (500 мКи / мл) на мл буфером для аликвоты буфера и сохранить буфер на льду.
- Удалить 10 мкл буфера, содержащего анализ 14 C и растворите его в 1 мл буфером. После обращения перемешать, добавить 100 мкл разбавленной 1:100 смеси 3 мл био-Safe II сцинтилляционных счет коктейль в сцинтилляционный флакон. Обратить перемешать. Сцинтилляционных импульсов (Beckman LS6500) должны быть более 18000 копий в минуту, прежде чем продолжить анализ.
- Когда достаточное количество NaH 14 CO 3 была добавлена к буфером,перемещения пробирок на сухую ванну настроен на 25 ° С и выдержите в течение 3-5 минут.
- Добавить 100 мкл аналитического буфера для лизатов и инкубировать 5 минут при 25 ° C.
- Добавить 20 мкл 15 бисфосфат рибулозо мм, образцов и позволяет протекания реакции в течение 5-10 мин при 25 ° C.
- Добавить 100 мкл пропионовой кислоты (100%) (Fisher), чтобы остановить реакцию. Центрифуга в течение 1 часа при 2000 мкг исчерпать неинкорпорированных 14 C.
- Трансфер от общего объема образцы сцинтилляционных флаконах, содержащих 3 мл био-Safe II сцинтилляционных счет коктейль. Определить стр кислоты стабильный конечный продукт сцинтилляционных счет (Б. С. Ю. Витте, Р. Табита личное сообщение).
- Рассчитать RUBISCO деятельности ставки по хл основе 14.
5. Представитель Результаты
Мы использовали обогащения культивирования изолировать адаптированных к холоду фототрофных и миксотрофных простейших, проживающие в Антарктике Lаке Бонни. Для захвата большего разнообразия организмов, мы протестировали три питательных сред типа: основной среды Жирный (BBM), 15, F/2-Si морской среднего 16, 17 и BG11 среднего 18. Визуальный осмотр обогащения культур с помощью световой микроскопии показали, что культуры преобладали фототрофных простейших (указано наличие пигмент хлорофилл, в большинстве клеток) и питали различные клетки морфологии в зависимости от выборки глубины, из которой был взят посевной и тип носителя, используемый в культуре (рис. 1).
Мы измерили максимальную скорость карбоксилазы деятельности катализируется ферментом RUBISCO в качестве прокси для углеродного потенциала фиксации. Хл изобилии также мониторинг в качестве оценки биомассы фототрофных protist (рис. 2). Несмотря на выращивание всех культур при той же температуре / световой режим (т.е. 4 ° C/20 мкмоль м -2 с -1), фиксации углерода потенциали биомассы фототрофных радикально изменился между обогащение культур. Максимальная RUBISCO активность наблюдалась в обогащение культур, растущих в любом BBM (обогащения 4 и 6) или BG11 (обогащение 13 и 14) рост средств массовой информации, в то время культур обогащенный на F / 2, рост среднего (19 обогащения, 21, 23), выставлены 4 - до 34 раз ниже максимально деятельности карбоксилазы. Эти различия не были в связи со снижением уровня биомассы в F / 2 культурах, как карбоксилазы деятельности была выражена Хл основе. Кроме того, RUBISCO деятельность не коррелирует с концентрацией хл (г = -0,023, р> 0,1;. Рис. 2, вставка). BBM культуры засевают озерной воды от 6 м до 15 м (обогащения 4 и 5) был самый высокий хл уровнях, в то время как все другие культуры выставлялись относительно низкой хл, независимо от активности фермента RUBISCO (рис. 2).
Рисунок 1.Представитель микробных эукариот обогащению культур, которые выбрали для роста разных организмов. Идентичность культуры дан в левом нижнем углу панели. Все изображения представляют собой свет микрофотографии создан с помощью погружения в масло 1000X увеличения.
Рисунок 2. Потенциальная емкость фиксации углерода и извлекаемые хлорофилла уровней в антарктических микробных эукариот обогащению культур, выделенных из озера Бонни и взрослых на различных носителях культуры. См. Таблицу 1 по культуре детали вставке. Корреляции Пирсона между хлорофиллом потенциального изобилия и фиксации углерода в антарктических микробных культур эукариот обогащения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Последние молекулярные исследования показали высокое разнообразие одноклеточных эукариот в целом ряде сред 3, 19, 20, однако из-за отсутствия изолятов по всему кругу protist обитания функциональной роли этих отдельных видов в пищевых цепях в основном неизвестно. В этом исследовании, мы описали методологии для обогащения для микробных видов эукариот выставке метаболических универсальность относительно undersampled окружающей среды, постоянно покрытых льдом антарктических озер. Культура обогащенный с разной глубины отбора проб на озере Бонни выставлены дифференциальных фиксации углерода ставки, которые были ростом средних зависимой. Например, низкий потенциал фиксации углерода в культурах, обогащенных F / 2 по сравнению с BBM или BG 11 питательной среды, вероятно, отражает различия в разнообразии protist и обмена веществ. BBM рост средней выбирает для зеленых водорослей (или хлорофитов) и нашей культуры оказываются монокультуры зеленых водорослей (рис.1а, б). Эти организмы, как известно, во многом зависит от photoautotrophy. Один изолировать от озера Бонни экспонатов чистый обмен фотоавтотрофного, имеющих строгие требования для легких в качестве единственного источника энергии 1. В отличие от F / 2, рост средней предназначен для обогащения широкого спектра морских простейших, в том числе потенциально миксотрофных организмов 12. Хотя мы не в полной мере изучить многообразие F / 2, культуры, микроскопический вид этих обогащения ясно показывают, консорциум простейших различной морфологии клетки (рис. 1в, г). Таким образом, снижение RUBISCO деятельности в F / 2 культурах может быть связано с использованием альтернативных углерод / энергию режимов приобретения. В подтверждение этого предсказания, чистых культур штаммов фотоавтотрофного Антарктики показывают значительно более высокие максимальные ставки RUBISCO карбоксилазы по сравнению с антарктической изолирует, которые проявляют mixotrophy (Dolhi и Морган-Kiss, неопубликованные результаты). Дальнейшие исследования гетеротрофных ЭНЦyme деятельности в этих образцов поможет в полной мере характеризует метаболические универсальность protist культуры обогащения и в настоящее время в нашей лаборатории. Кроме того, физиологические данные, описанные в этой статье будет дополнен филогенетического и метагеномных последовательности информации в рамках больших усилий последовательности охарактеризовать микробных сообществ во всем мире называют проектом Земли микробиомом ( http://www.earthmicrobiome.org/~~V ) .
Изменение фильтра анализа описанных в настоящем докладе также может быть применен к Клеточный лизат, извлеченные из образцов фильтром воды озера. Тем не менее, для новых приложений этого анализа, оптимальный объем лизата должны быть определены путем анализа трех различных объемов и использование того, что дает копий в минуту по крайней мере от 3 до 4 раз по сравнению с отрицательным контролем. Анализ углеродного потенциала фиксации в сочетании с анализом ферментативной гетеротрофных деятельти в природных сообществах protist даст более детальное представление о роли protist способность трофических и круговорота углерода в водной среде. Мы в настоящее время применение этого подхода к пониманию роли абиотических факторов среды в protist метаболических универсальность в озере Бонни и других озер Антарктики. Карбоксилазы RUBISCO фильтр метод анализа станет ценным инструментом для изучения потенциальных фиксации углерода и метаболических универсальность в небольших масштабах обогащения культур, а также целые системы озер.
До развития выращивания независимых молекулярных инструментов, простейших, традиционно определенные выращивания и таксономически классифицированы в зависимости от их морфологии клеток. Таким образом, существует долгая история обогащения и выделения простейших проживающих в самых разнообразных местах обитания. Первые исследования, в частности, исторически ценный для подробного выявления таксономического (см. обзор: 21, 22). В то время как изоляция простейшихиспользование обогащение подходов относительно редки в среде Антарктики пресной водой, несколько морских изолятов protist от обогащения морской воды Антарктики доступны 23-26. Кроме того, несколько сборников культуры посвящены protist и микроводорослей изоляты (например, для: Provasoli-Guillard коллекции культур, https://ncma.bigelow.org/~~V ). Надежные и дешевые технологии секвенирования произвели массовый генетический базу данных необработанной последовательности protistan. Хотя эти базы данных были очень информативны в отношении разнообразия и распространения этой важной группы микроорганизмов, есть увеличивающийся разрыв в связи последовательности данных с нашего понимания экологии protist и физиологии. Таким образом, традиционные методы культивирования, в частности, в undersampled средах, таких как полярные водной среды обитания будет продолжать играть важную роль на пути к пониманию важности и экологической ролипротистов в глобальных геохимических велосипеде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность И. Priscu, А. Chiuchiolo и Мак-Мердо LTER лимнологии команде за помощь в сборе и сохранении образцов в Антарктиде. Мы благодарим Ratheon Полярный Услуги и PHI вертолетов для материально-технического обеспечения. Свет снимках были получены в центре Майами перспективных микроскопии и обработки изображений центра. Эта работа была поддержана NSF Управления Полярный грантов Программы 0631659 и 1056396.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBM | Sigma-Aldrich | B5282 | |
| BG11 | Sigma-Aldrich | C3061 | |
| F/2 | Sigma-Aldrich | G9903 | |
| GF/F filter, 25 mm | Fisher Scientific | 09-874-64 | |
| GF/F filter, 47 mm | Fisher Scientific | 09-874-71 | |
| Polyethersulfone filter, 0.45 μm pore, 47 mm | Pall Corporation | 61854 | |
| Sterile cell culture flask, 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Diurnal growth chamber | VWR international | 35960-076 | |
| Zirconia/silica beads, 0.1 mm diamter | Biospec Products | 11079101z | |
| Mini-Bead beater | Biospec Products | 3110BX | |
| Screw-cap microcentrifuge tube (1.5 μL) | USA Scientific, Inc. | 1415-8700 | |
| NaH14CO3 | ViTrax | VC 194 | Keep in aliquots of 400 μL at -20°C |
| RuBP | Sigma-Aldrich | R0878-100mg | Dissolve in 10 mM Tris-propionic acid (pH 6.5) |
References
- Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. P., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Hüner, N. P. A. Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments. Microbiol Mol. Biol. Rev. 70, 222-252 (2006).
- Priscu, J. C., Wolf, C. F., Takacs, C. D., Fritsen, C. H., Laybourn-Parry, J., Roberts, J. K. M., Berry-Lyons, W. Carbon transformations in the water column of a perennially ice-covered Antarctic Lake. Biosci. 49, 997-1008 (1999).
- Caron, D. A., Worden, A. Z., Countway, P. D., Demir, E., Heidelberg, K. B. Protists are microbes too: a perspective. ISME J. 3, 4-12 (2009).
- Bielewicz, S., Bell, E. M., Kong, W., Friedberg, I., Priscu, J. C., Morgan-Kiss, R. M. Protist diversity in a permanently ice-covered Antarctic lake during the polar night transition. ISME J. 5, 1559-1564 (2011).
- Laybourn-Parry, J.
- Roberts, E. C., Laybourn-Parry, J. Mixotrophic cryptophytes and their predators in the Dry Valley lakes of Antarctica. Freshwat. Biol. 41, 737-746 (1999).
- Roberts, E. C., Priscu, J. C., Laybourn-Parry, J. Microplankton dynamics in a perennially ice-covered Antarctic lake-Lake Hoare. Freshwat Biol. 27, 238-249 (2004).
- Bell, E. M., Laybourn-Parry, J. Mixotrophy in the Antarctic phytoflagellate Pyramimonas gelidicola. J. Phycol. 39, 644-649 (2003).
- De Wever, A., Leliaert, F., Verleyen, E., Vanormelingen, P., Van der Gucht, K., Hodgson, D. A. Hidden levels of phylodiversity in Antarctic green algae: further evidence for the existence of glacial refugia. Proc. Biol. Sci. , 276-3591 (2009).
- Laybourn-Parry, J.
- Lizotte, M. P., Priscu, J. C. Distribution, succession and fate of phytoplankton in the dry valley lakes of Antarctica, based on pigment analysis. Ecosystem Dynamics in a Polar Desert: The McMurdo Dry Valleys. Priscu, J. C. , 229-240 (1998).
- Ellis, R. J.
- Tortell, P. D., Martin, C. L., Corkum, M. E. Inorganic carbon uptake and intracellular assimilation by subarctic Pacific phytoplankton assemblages. Limnol. Oceanogr. 51, 2102-2110 (2006).
- Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F. New spectrophotometric equations for determining chlorophyll a, b, c1, c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanz. 167, 191-194 (1975).
- Morgan, R. M., Ivanov, A. G., Priscu, J. C., Maxwell, D. P., Hüner, N. P. A. Structure and composition of the photochemical apparatus of the Antarctic green alga, Chlamydomonas subcaudata. Photosyn. Res. 56, 303-314 (1998).
- Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of Marine Invertebrate Animals. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Plenum Publishing. New York. 29-60 (1975).
- Johnson, M. D., Tengs, T., Oldach, D., Stoecker, D. K. Sequestration, performance, and functional control of cryptophyte plastids in the ciliate Myrionecta rubra (Ciliophora. J. Phycol. 42, 1235-1246 (2006).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J., Herdman, M., Stanier, R. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Not, F., del Campo, J., Balague, V., De Vargas, C., Massana, R. New insights into the diversity of marine picoeukaryotes. PLoS ONE. 4, e7143 (2009).
- Sherr, B. F., Sherr, E. B., Caron, D. A., Vaulot, D., Worden, A. Z.
- Finlay, B. J. Protist taxonomy: an ecological perspective. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 359, 599-610 (2004).
- Foissner, W.
- Gast, R. J., Moran, D. M., Dennett, M. R., Caron, D. A. Kleptoplasty in an Antarctic dinoflagellate: caught in evolutionary transition. Environmental Microbiology. 9, 39-45 (2007).
- Gast, R. J., Moran, M. A., Beaudoin, D. J., Blythe, J. N., Dennett, M. R., Caron, D. A. High abundance of a novel dinoflagellate phylotype in the Ross Sea. Antarctica. J. Phycol. 42, 233-242 (2006).
- Moran, D. M., Anderson, O. R., Dennett, M. R., Caron, D. A., Gast, R. J. A Description of Seven Antarctic Marine Gymnamoebae Including a New Subspecies, Two New Species and a New Genus: Neoparamoeba aestuarina antarctica n. subsp., Platyamoeba oblongata n. sp., Platyamoeba contorta n. sp. and Vermistella antarctica n. gen. n. sp. Journal of Eukaryotic Microbiology. 54, 169-183 (2007).
- Rose, J. M., Vora, N. M., Countway, P. D., Gast, R. J., Caron, D. A. Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist. The ISME journal. 3, 252-260 (2009).
