Summary
En optisk system ble utviklet for å visualisere nedsatt mikrosirkulasjon med FITC-merkede erytrocytter og å måle partialtrykket av oksygen i microvessels med laser-assistert phosphorimetry. Denne metoden kan brukes til å undersøke fysiologiske og patologiske mekanismer ved å analysere mikrovaskulær struktur, diameter, blodstrøm hastighet, og oksygen spenning.
Abstract
Det er en betydelig diskrepans mellom oksygentilførsel og etterspørsel i leveren fordi nedsatt oksygenopptak er relativt høy, men ca 70% av nedsatt blodgjennomstrømning er dårlig oksygenert portvenen blod stammer fra mage-tarmkanalen og milt. Oksygen er levert til hepatocytter ved blod som strømmer fra en terminal gren av portvenen til en sentral venule via sinusoids, og dette gjør en oksygen gradient i hepatiske lobules. Oksygenet Stigningen er en viktig fysisk parameter som involverer uttrykk av enzymer oppstrøms og nedstrøms ved nedsatt mikrosirkulasjon, men mangel på teknikker for måling av oksygenforbruk i leverens mikrosirkulasjon har forsinket belyse mekanismer knyttet til oksygen metabolisme i leveren. Vi benyttet derfor FITC-merket erytrocytter å visualisere nedsatt mikrosirkulasjon og brukte laser-assistert phosphorimetry å måle partialtrykket av oksygen i microvessels der. Noncontact og kontinuerlig optisk måling kan kvantifisere blodstrøm hastigheter, fartøy diametre, og oksygen graderinger relatert til oksygenforbruk i leveren. I en akutt hepatitt modell laget vi ved å gi paracetamol til mus vi observerte økt oksygentrykket i både portal og sentrale venules men en redusert oksygen gradient i sinusoids, noe som indikerer at hepatocytter nekrose i pericentral sonen kunne forskyve oksygentrykket opp og påvirke enzymet uttrykk i periportal sonen. I konklusjonen, kan våre optiske metoder for måling av hepatiske hemodynamikken og oksygenforbruk avsløre mekanismer relatert til leversykdom.
Protocol
1. Merking Erytrocytter med Fluorescein isothiocyanate isomeren I (FITC)
Alle de eksperimentelle protokollene vi brukte ble godkjent av Animal Care komité Keio University School of Medicine.
- Anesthetize en donor mus, og etter at en celiotomy snitt trekke fullblod fra inferior vena cava med en 1-ml sprøyte som inneholder små mengder heparin. Musen ble umiddelbart avlivet av natrium pentobarbital injeksjon (100 mg / kg ip).
- Vask fullblod to ganger med PBS (pH 7,4) ved sentrifugering i 5 min ved 400 g i en svingende-bøtte rotor.
- Oppløs 10 mg av FITC i 5 ml 100 mM Na 2 HPO 4 og filtrere den med en membran som har 0.22-mikrometer porene.
- I en test tube bland 1 ml av FITC løsning med 0,15 ml 3 mm glukose, 0,25 ml 180 mM NaH 2 4 PO, og 1,5 ml av 100 mM Na 2 HPO 4. Legg 0,2 ml av RBC pellet, og trykk på røret for miksing.
- Hold røret i 2 timer ved 4 ° C og deretter vaske de fargede RBCs i PBS to ganger.
- Sett en liten mengde av RBC suspensjon på et lysbilde gress og se om RBCs ser sunt (dvs. at deres form og størrelse er normal) og at fluorescensintensiteten er tilstrekkelig.
- Heng 0,1 ml RBCs i 0,9 ml PBS ved pH 7,4, og holde suspensjon ved 4 ° C til injeksjon.
2. Utarbeidelse av Oxygen-sensitive Dye
- Løs 500 mg av BSA i 10 ml PBS ved pH 7,4.
- Tilsett 30 mg av PD (II)-meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphine (PD-TCPP) til BSA løsningen og rør over natten.
- (Valgfritt) Utdrag BSA-bundet Pd-TCPP ved hjelp av tyngdekraften flyt kromatografi eller en spinn kolonne for å skille den fra gratis PD-TCPP.
- Sentrifuger løsningen for å fjerne uoppløst Pd-TCPP, og filtrere supernatanten med en membran filter har 0.22-mikrometer porene. </ Li>
- Oppbevar 1-ml alikvoter i rørene ved -20 ° C. Unngå gjentatte fryse-tine sykluser.
3. Animal Forberedelse
- For mikroskopisk observasjon av mikrosirkulasjonen forberede en plastplate med hull 20 mm i diameter, og tape en 30-mm-kvadrat kvadratisk deksel glass over hullet.
- Anesthetize en mus, fjerne pelsen, og prep huden. Plasser et kateter i halen forgjeves for sprøytebruk ved hjelp av en 30 G nål koblet til en 10-cm polyetylen (PE 10) kateter fylt med heparinisert PBS.
- Etter median snitt, utvide en hoved lobule av leveren på plast plate, og plasserer musen i sternal recumbency.
- Forbered små glipper med kjøkken sjal (3 mm x 8 mm) og flis dem rundt kanten av nedsatt lapp å hemme flyttingen av leveren med åndedrett og holde den mot uttørking.
- Observer nedsatt mikrosirkulasjonen under et mikroskop (med overført lys), og bekrefter at blood flyt har ingen stasis i synsfeltet i minst 15 min.
- Sakte injisere 0,2 ml fluorescensmerkede RBCs for blodstrøm observasjon eller 0,2 ml av PD-TCPP løsning for PO 2 måling. Denne mengden FITC-merkede RBCs vil stå for 1/50 av alle RBCs i omløp i visualisert regionen.
4. Blood Flow Visualization
- Interesserer FITC ved å bestråle den med kvikksølv lampe lys som har passert gjennom en båndpassfilter (450-490 nm) en.
- Ta opp den fluorescerende bildet med en CCD-kamera.
5. PO 2 Måling
PD-TCPP morilden er relativt svak og bør oppdages med en høy følsomhet detektor. Alle eksperimenter må utføres i et mørkt rom.
- De absorpsjon toppene av PD-TCPP er på 410 nm og 532 nm, så det nest harmoniske bølgelengde 532 nm anbefales for eksitasjon. Denne bølgelengden kan genereres av en Nd: YAG puls laser to.
- Fôr strålen fra Nd: YAG laser i det aktuelle porten på invertert mikroskop, og justere strålen stedet til en sentral posisjon i fokusplanet. Den romlige oppløsningen avhenger av laser spot størrelse, som endres ved å sende strålen gjennom et pinhole.
- Å oppdage morilden, feste en lang-pass filter (> 620 nm) og en photomultiplier tube (PMT) til den andre porten av mikroskopet. Den PMT bør være følsomme for røde bølgelengder, spesielt rundt 700 nm.
- Smak morilden signal (500 poeng samplet på 200 kHz) og beregne tiden konstant av forfallet ved å montere en eksponentiell funksjon til forfall.
- For kalibrering forberede to sett prøver av PD-TCPP løsning med PO 2 150 mmHg og 0 mmHg. Legg dithionite natrium 1% i volum for å prøve å produsere fravær av oksygen. Hold pH prøvene ved 7.4 og temperaTure ved 37 ° C under kalibrering.
- Fest Stern-Volmer konstant k q og oksygen-fri luminescence decay tid τ 0 i ligning (1) 3. I vårt tilfelle, med PD-TCPP løsninger ved 37 ° C og en pH på 7,4, er k q 374 mmHg -1 s -1 og τ 0 er 0,74 ms. Disse måleparametere avhengig av utstyr (dvs. laser, detektor, andre optiske enheter) og signalbehandling metoden, så kalibrering er nødvendig i hvert målesystem 4.
τ 0 / τ = 1 + k q • τ 0 • PO 2 (1) - Sett musen på tallerkenen på mikroskopet scenen, observere nedsatt mikrosirkulasjonen, og justere plasseringen av målet microvessel til det punktet av laser spot.
6. Hepatitt Model
- Raske mus med fri tilgang til vann over natten.
- Forbered en20 mg per ml løsning av paracetamol (APAP) i DMSO.
- Injisere den intraperitonealy på en ml/100 g kroppsvekt (dvs. 200 mg / kg kroppsvekt). Etter injeksjonen, kan du bruke musen gis fri tilgang til mat og vann fem.
- 24 timer etter injeksjonen, anesthetize musen og utsetter leveren ved å lage en median snitt. Dersom hepatitt oppnås, vil nekrose i pericentral regionen være lett synlig for det blotte øye.
7. Representative Resultater
Eksempel bilder av nedsatt mikrosirkulasjon er vist i Figur 1, der (a) er utsendt lys image og (b) er en fluorescens bilde. Individuelle FITC-merkede erytrocytter er observert i videoen filmen, og portalen venules og sinusoids og sentrale venules er anerkjent av blodstrøm retninger.
Som vist i figur 2, var det laser spot bestråle en sentral venule gjennom en x100 objektiv approximbart 10 mikrometer i diameter. Intravaskulær PO 2 i leverens mikrosirkulasjon ble målt i mannlig C57BL / 6 mus, og figur 3 (a) viser forholdet mellom PO 2 og fartøy diameter på portalen og sentrale venules. Den PO to gradient fra portal til sentrale venules indikerer at RBCs utgivelsen oksygen effektivt mens passerer gjennom sinusoids. Som vist i figur 3 (b), var gjennomsnittlig PO 2 59,8 mmHg i portalen fartøyer, 48,2 mmHg i sinusoids og 38,9 mmHg i sentrale venules.
Når vi produsert akutt hepatitt ved å injisere APAP intraperitonealy ble intravaskulær Postboks 2 signifikant forhøyet i hver del av nedsatt mikrosirkulasjon: p <0,05 i portal årer og p <0.01 i sinusoids og sentrale vener (figur 3 (c)).
Figur 1. Low-forstørrelse iMages viser nedsatt mikrosirkulasjon med (a) overført lys og (b) fluorescens.
Figur 2. Bilde av laser spot bestråle en målrettet sentral venule for PO 2 måling.
Figur 3. PO to gradient i nedsatt mikrosirkulasjon av friske kontrollpersoner mus og mus med paracetamol-indusert leverskade. (A) viser Postboks 2 versus fartøy diameter for portalen venules (PV) og sentral venules (CV), og (b) viser oksygen gradient fra PV til CV via sinusoids (S). Den PO 2 Forskjellen mellom PV og CV reflekterer oksygen forbruket av hepatocytter eller andre parenkymatøs celler. (C) viser at i hepatitt forhold forårsaket av APAP administrasjonen, ble Postboks 2 signifikant forhøyet i PV, S, og CV og PO 2gradient redusert, noe som indikerer at nedsatt oksygenopptak ble kompromittert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levere oksygen til vevene er en viktig rolle mikrosirkulasjonen, og en masse papirer beskrive sykdommer relatert til microvessel anatomi og reologi 6. Liver blodstrøm er en kombinasjon av arterielle og venøse blod. Omtrent 30% av blodstrøm til leveren er godt oksygenrikt blod levert av nedsatt arterien og den andre 70%, gitt av portvenen, er det dårlig oksygenrikt blod venøs utstrømning fra milten og mage-tarmkanalen 7. Leversykdommer som fettlever, støt eller svulst endring blodstrømmen i leverens mikrosirkulasjon. For å bestemme vevsoksygenering, må man måle både blodstrøm og oksygen konsentrasjon i mikrosirkulasjonen. Mangelen på kommersielt tilgjengelige virkemidler for å gjøre disse målingene i leverens mikrosirkulasjon har gjort det vanskelig å få fysiologiske data i dette feltet.
Et viktig poeng i animalske forberedelse trinn er fiksering avleveren på en plastplate. Løse fiksering resulterer i leveren bevegelse synkronisert med åndedrett, som forstyrrer mikroskopisk observasjon og gjør analyser vanskelig. Tett fiksering, men fører blodstrøm stasis. Blood strømningsforhold bør observeres om en laveffekts mikroskop under operative inngrepet. High-lasere lett skade microvessels, slik at frekvensen av bestråling bør minimaliseres. 1 Hz er vanligvis nok for temporal måling åtte. Men tar en enkelt måling av PO 2 mindre enn 1 ms, noe som betyr at gjentakelsen frekvensen kan økes til 1 kHz for rask PO to endring, som er nødvendig. Videre genererer fotokjemisk reaksjon av PD-TCPP singlet oksygen som skader microvessels og induserer trombocyttaggregasjon 9. Kombinasjonen av fluorescens bildebehandling og PO to måling kan måle blodstrøm dynamikk og oksygenkonsentrasjonen alle sammen. Den kvikksølvlampe bestrålingspennende FITC pirrer også Pd-TCPP imidlertid, og dermed skape mye singlet oksygen og fører til blodstrømmen stasis. Når både blodstrøm og oksygen spenning måles i samme dyr, bør FITC bildebehandling gjøres før PD-TCPP administreres. I tillegg er systemisk oksygen nivået beskrivende for oksygenforbruk i vevet. Det anbefales å utføre luftveiene ledelsen under eksperimenter eller analysere blod gass nivåer etter eksperimenter.
Vi brukte APAP å indusere akutt hepatitt, blant annet fordi en høy dose av APAP er kjent for å føre til celle nekrose i pericentral regionen 10. Delvis oksygentrykket måling viste 20,9-mmHg PO 2 forskjellen mellom portal venules og sentrale venules i kontroll mus redusert til 16,9 mmHg i APAP-behandlede mus og at PO 2 var høyere gjennom hele nedsatt mikrosirkulasjonen. Den oksygen gradient i leverens mikrosirkulasjon er i hovedsak et resultat av oksygen supplstudert fra portalen venules blir konsumert i hepatocytter. Jo høyere dose av APAP induserer nekrose i pericentral regionen 11, 12, og som kunne redusere oksygen forbruket nedstrøms som vist i Figur 3c. For å bestemme detaljerte mekanismene bak leveren hepatitt, spesielt forholdet mellom vevsnekrose og oksygennivå, kvantifisering av omfanget av nekrose, og serumnivået av bilirubin, ALAT, ASAT, og inflammatoriske cytokiner må måles. Mange av leversykdommer er relatert til nedsatt mikrosirkulasjon, med andre ord, til blodstrømmen distribusjon, oksygentilførsel, og oksygenforbruk i leveren vev. I tilfeller av kronisk alkohol inntak, er omtrent 10-15% av alkohol metaboliseres av mikrosomalt etanol-oksiderende system, og alkohol-indusert molekylet P450IIE1 genererer 13 NAPQI, en giftig metabolitt som fører til pericentral hepatocytter nekrose 14.
I konklusjonen, vår optisk measurement metoden kan brukes til å undersøke fysiologiske og patologiske mekanismer ved å analysere mikrovaskulær struktur, diameter, blodstrøm hastighet, og oksygen spenning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfattere takke Ms Risa Otsuka for teknisk assistanse og hjelpe eksperimenter. Denne forskningen ble delvis støttet av departementet for utdanning, vitenskap, sport og kultur, Grant-i-Aid Unge Forskere (B), 2010, 22700476, og Suzuken Memorial Foundation 2010 for KT og denne studien ble støttet av forskning og utvikling av Next-Generation Integrert Simulering av levende materie, en del av utvikling og bruk av neste-generasjons superdatamaskin prosjekt MEXT, og dels ved JST ERATO Suematsu Gas Biology Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
- Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system. Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).
- Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation. J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).
- Stern, O., Volmer, M. Über die Abklingzeit der Fluoreszenz. Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Soga, T. Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).
- Goda, N. Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation. J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).
- Grote, J. Physiologie der Menschen. , 20th edn, Springer-Verlag. New York. 560 (1980).
- Suganuma, K. Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction. Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J.
- Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P.
- Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition. Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).
- Lieber, C. S. Medical disorders of alcoholism. N. Engl. J. Med. 333, 1058-1065 (1995).
- Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure. Hepatology. 22, 767-773 (1995).
