Summary
光学系は、FITC標識赤血球と肝微小循環を可視化するために、レーザーアシストりんと血管中の酸素分圧を測定するために開発されました。このメソッドは、微小血管の構造、直径、血流速度、および酸素分圧を分析することにより、生理学的および病理学的メカニズムを調べるために使用することができます。
Abstract
肝酸素消費量が比較的高いですが、肝臓の血液供給の約70％が胃腸管および脾臓由来の門脈血を酸素化されているため、肝臓の酸素需要と供給の間にかなりの食い違いがあります。酸素は、正弦波を介して中央静脈に門脈終末枝から流れる血液によって肝臓に配信され、これは肝小葉内の酸素勾配になります。酸素勾配は、肝微小循環におけるアップストリームおよびダウンストリームの酵素の発現を伴う重要な物理パラメータであるが、肝微小循環の酸素消費量を測定するための技術の欠如は、肝臓での酸素代謝に関わるメカニズムの解明を遅らせました。そこで我々は肝微小循環を可視化するためにFITC標識赤血球を使用し、そこに血管中の酸素分圧を測定するためにレーザーアシストりんを使用していました。 NoncontaCTと連続的な光学的測定は、血流速度、血管径、肝臓での酸素消費量に関連した酸素勾配を定量化することができます。急性肝炎モデルでは、我々は中心周辺のゾーン内の肝細胞壊死が酸素分圧をシフトアップと酵素の発現に影響を与える可能性があることを示し、我々はポータルと中央静脈の両方で増加した酸素分圧が正弦波で減少した酸素勾配を観察したマウスにアセトアミノフェンを投与することにより行われ門脈ゾーンインチ結論として、測定の肝血行動態および酸素消費のために私たちの光学的方法では、肝疾患に関連するメカニズムを明らかにすることができます。
Protocol
1。フルオレセインイソチオシアネート異性体I（FITC）で標識赤血球
我々が使用するすべての実験的なプロトコルは、慶應義塾大学医学部の動物ケア委員会によって承認された。
- ドナーマウスを麻酔し、行った後、腹腔切開術は、ヘパリンの少量を含む1mlのシリンジで下大静脈から全血を取り消すことができます。マウスはすぐにペントバルビタールナトリウム注射（100 mg / kgのIP）によって安楽死させた。
- スイングバケットローターで400 グラムで5分間遠心分離によってPBS（pH7.4）で二回全血を洗う。
- の100mM Na 2 HPO 4、5 mlのFITCの10mgを溶解し、0.22μmの細孔を有する膜でそれをフィルタリングします。
- 試験管に180 mMの0.25ミリリットルのNaH 2 PO 4、及び100mMのNa 2 HPO 4 1.5 mlの、3 mMのグルコースの0.15ミリリットルとFITC溶液1mlを混ぜます。 Rの0.2ミリリットルを追加します。BCペレットと混合するためのチューブをタップします。
- 4°Cで2時間チューブを保持し、PBSで2回ステンド赤血球を洗浄する。
- スライドの芝生の上でRBC懸濁液の少量を入れて、赤血球は健康に見えるかどうか（すなわち、その形状や大きさが正常であること）と蛍光強度が十分であること。
- pH7.4のPBS 0.9 mlの赤血球の0.1 mlを中断し、4℃で懸濁液を保つ°Cを注入するまで。
2。酸素感受性色素の調製
- pH7.4のPBSの10mlのBSA 500 mgを溶解する。
- BSA溶液にパラジウム（II） - メソ - テトラ（4 - カルボキシフェニル）ポルフィン（PD-TCPP）の30 mgを追加し、一晩攪拌する。
- （省略可能）フリーのPd-TCPPからそれを分離する重力流クロマトグラフィーまたはスピンカラムを用いてBSAに結合したパラジウムTCPPを抽出します。
- パラジウムTCPP溶解除去し、0.22μmの細孔を有するメンブランフィルターで上清をフィルタリングするためのソリューションを遠心分離します。 </ LI>
- -20℃でチューブ内の店舗1mlのアリコート凍結融解の繰り返しを避けることができます。
3。動物の準備
- 微小循環の顕微鏡観察用の穴に比べて30 mm角の正方形のカバーガラス孔20の直径mmとし、テープでプラスチック板を準備します。
- マウスを麻酔し、肌に毛皮を削除し、準備。ヘパリン化PBSで満たされた10cmのポリエチレン（PE 10）カテーテルに接続されている30 G針を使用して、薬剤注入のための無駄な尾部にカテーテルを挿入します。
- 正中切開した後、プラスチックプレート上に肝臓の主な小葉を拡張し、伏臥でマウスを置きます。
- 呼吸と肝臓の移動と乾燥からそれを維持抑制するために肝葉の縁の周りにキッチンラップ（3ミリメートル×8 mm）とタイル一緒に小さなスリップを準備します。
- 顕微鏡下での肝微小循環を（透過光で）観察すると、bていることを確認lood·フローは、少なくとも15分間の視野内にうっ滞がありません。
- 徐々に血流の観察またはpO 2は測定用のPd-TCPP溶液0.2mlのために蛍光標識した赤血球の0.2ミリリットルを注入します。 FITC標識赤血球のこの量は、可視化領域内の循環内のすべての赤血球の1/50を占めることになる。
4。血液の流れの可視化
- バンドパスフィルタ（450から490 nm）の1を通過した水銀灯の光でそれを照射することにより、FITCを励起する。
- CCDカメラによる蛍光像を記録します。
5。はpO 2測定
PD-TCPP燐光は比較的弱く、高感度の検出器で検出する必要があります。すべての実験は暗い部屋で実行する必要があります。
- パラジウムTCPPの吸収ピークは410 nmと532 nmであるので、第二高調波の波長532 nmの励起をお勧めします。 YAGパルスレーザー2：この波長はNdによって生成することができます。
- 倒立顕微鏡上の適切なポートにYAGレーザーと、焦点面の中央の位置にビームスポットを調整する：NDからのビームを供給します。空間分解能はピンホールを介してビームを渡すことによって変更されるレーザーのスポットサイズに依存します。
- 燐光を検出するために、顕微鏡の他のポートへのロングパスフィルター（> 620 nm）と光電子増倍管（PMT）を添付してください。 PMTは、特に700 nm付近に、赤の波長に敏感でなければなりません。
- 燐光信号（200 kHzでサンプリングされた500点）をサンプリングし、崩壊の指数関数をフィッティングすることにより、減衰の時定数を計算します。
- キャリブレーション用のPO 2 150 mmHgで、0 mmHgでのPd-TCPPソリューションのサンプルの2セットを準備します。酸素の有無を生成するためにサンプリングするために亜ジチオン酸ナトリウムの体積の1％を追加します。 7.4でサンプルのpHと温度を保つ校正時37℃トゥーレ。
- スターン-ボルマー定数k qと無酸素の発光減衰時間式のτ0（1）3を修正します 。 37°Cと7.4のpHでのPd-TCPPソリューションと我々のケースでは、K Qは 374 mmHgで-1 s -1であり、τ0は 0.74ミリ秒です。これらの測定パラメータは、機器（すなわち、レーザー、検出器、その他の光学機器）、および信号処理方法によって異なりますので、キャリブレーションは、各測定システム4で必要とされる。
τ0 /τ= 1 + K Q•τ0•pO 2は （1） - 顕微鏡ステージ上にプレートの上にマウスを設定し、肝微小循環を観察し、レーザスポットの点にターゲット微小血管の位置を調整します。
6。肝炎モデル
- 一晩水に自由にアクセスの高速マウス。
- 準備するDMSO中のアセトアミノフェンmlの溶液（APAP）あたり20 mgである。
- 1 ml/100グラム体重（すなわち、200 mg / kg体重）で腹腔内に注入します。注入後、マウスが食料と水5への無料アクセスを与えることができます。
- 注射後24時間は、マウスを麻酔し、正中切開を行うことによって肝臓を公開します。肝炎が達成されている場合は、中心周辺の地域の壊死が肉眼で容易に見えるようになります。
7。代表的な結果
肝微小循環のサンプル画像は、（a）透過光像であり、（b）の蛍光画像である図1に示されています。個々のFITC標識赤血球をビデオムービーで観察され、ポータル静脈、正弦波、中央静脈の血流の方向で認識されます。
図2に示すように、X100の対物レンズを介して中央静脈を照射するレーザスポットはapproximでした直径ately10μmである。肝微小循環における血管内のpO 2は、雄C57BL / 6マウス、および図3（a）で測定したpO 2は 、ポータルと中央静脈の血管径との関係を示しています。正弦波を通過しながら、ポータルからの中央静脈にpO 2は勾配が効率的にその赤血球リリース酸素を示しています。 図3（b）に示すように、平均pO 2は、ポータル船舶、正弦波では48.2 mmHgで、中央静脈で38.9 mmHgで59.8 mmHgであった。
我々はAPAP腹腔内に注入することにより急性肝炎を生成する場合は、血管内のpO 2は有意に肝微小循環の各部分で上昇していた：P正弦波と中心静脈（図3（c））における門脈およびp <0.01 <0.05。
図1低倍率I魔道士は、（a）透過光および（b）蛍光と肝微小循環を示している。
図2はpO 2測定の対象となる中心的な静脈を照射するレーザスポットのイメージ。
健康な対照マウスのアセトアミノフェン誘発肝傷害マウスの肝微小循環の図3。pO 2は勾配。 （1）PO 2対ポータル静脈（PV）と中央静脈（CV）の血管径を示し、（b）は正弦波（S）を介してPVからCVへの酸素勾配を示しています。 PVとCVの間にはpO 2の違いは、肝細胞または他の実質細胞の酸素消費量を反映しています。 （C）APAP投与により誘導される肝炎の状態で、PO 2が大幅にPV、S、およびCVとはpO 2で上昇したことを示しています勾配は、肝酸素消費量が危険にさらされたことを示す、減少した。
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Discussion
組織に酸素を提供することは微小循環の重要な役割であり、論文の多くは、微小血管の解剖学とレオロジー6に関連する疾患について説明します。肝血流量は動脈と静脈血の組み合わせです。肝臓への血流の約30％が門脈によって提供された肝動脈と他の70％で提供されるだけでなく酸素化血液は、脾臓、消化管7からの不十分な酸素血静脈流出である。そのような脂肪肝、衝撃、または腫瘍の変化などの肝疾患の肝微小循環の血流。組織の酸素化を決定するためには、微小循環における血流と酸素濃度の両方を測定する必要があります。肝微小循環に、これらの測定を行うための市販の機器の欠如は、それが難しいこの分野での生理学的データを得るために行われています。
動物の準備段階で重要なポイントは、固定です。プラスチック板上での肝臓。肝臓の動きに緩い固定の結果は、顕微鏡観察を妨害すると解析が困難になり呼吸と同期。タイトな固定は、しかし、血流うっ滞を引き起こします。血流の条件は手術手順の実行中に、低消費電力顕微鏡かかわらず、観察されるべきである。ハイパワーレーザーは容易に血管を傷つけ、照射の頻度を最小限に抑える必要があるので。 1 Hzのは、通常、一時的な測定8で十分です。しかし、pO 2は 、単一の測定は、繰り返し周波数は必要に応じて、迅速なpO 2は変化が1 kHzに増加させることができることを意味する1ミリ秒未満を受け取ります。また、PD-TCPPの光化学反応は、損害賠償血管いる一重項酸素を生成し、血小板凝集9を誘導する。蛍光イメージングとはpO 2測定の組み合わせは、すべて一緒に血流動態と酸素濃度を測定することができます。水銀ランプ照射エキサイティングFITCはまた、それによって多くの一重項酸素を生成し、血流停滞につながる、しかし、PD-TCPPを励起する。パラジウムTCPPが投与される前に、血流と酸素分圧の両方が同じ動物で測定されたときに、FITCイメージングが行われるべきである。さらに、全身の酸素レベルは、組織の酸素消費量の指標である。実験中に呼吸管理を実行したり、実験した後に血液ガスレベルを分析することが好ましい。
APAPの高用量は、中心周辺の領域10に細胞壊死を引き起こすことが知られているので、我々は部分的には、急性肝炎を誘導するためにAPAPを使用していました。酸素分圧の測定は、PO 2は肝微小循環を通して高かったコントロールマウスのポータル静脈と中央静脈の間に20.9-mmHgではpO 2の違いはAPAP投与マウスでは16.9 mmHgに減少を示します。肝微小循環の酸素勾配は主に酸素の品質向上の結果である肝細胞で消費されているポータル静脈からiedを。 APAPの高用量では、中心周辺の領域11、12に壊死を誘導し、 図3cに示すように、下流の酸素消費量を減少させる可能性があります。肝肝炎、組織壊死と酸素レベルとの間の特に関係、壊死の程度を定量化し、ビリルビン、ALT、AST、および炎症性サイトカインの血清レベルの基礎となる詳細なメカニズムを決定するためには、測定する必要があります。肝疾患の多くは、肝組織における血流分布、酸素運搬、酸素消費量に、換言すれば、肝臓の微小循環に関係しています。慢性的なアルコール摂取の場合には、アルコールの約10-15％がミクロソームエタノール酸化系によって代謝され、アルコール誘発性分子P450IIE1はNAPQI 13、中心周辺の肝細胞壊死14に導くその毒性代謝物を生成します。
結論として、私たちの光学測定surement法は微小構造、直径、血流速度、および酸素分圧を分析することにより、生理学的および病理学的メカニズムを調べるために使用することができます。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、技術援助と支援の実験のためにさんりさ大塚に感謝します。この研究は部分的に教育、科学、スポーツ文化省によってサポートされていました、若手研究（B）、2010、22700476、及びKTのためにスズケン記念財団2010年、この研究費補助金は、研究開発によってサポートされていましたリビング物質の次世代統合シミュレーション、文部科学省次世代スーパーコンピュータ·プロジェクトの開発と利用の一部であり、JST ERATO末松ガス生物学プロジェクトによって一部インチ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
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