Summary
在这里，我们详细介绍了小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的快速分离方法。使用多色流式细胞仪分析细胞分选磁珠富集而被用来产生高纯度的功能研究人口肠道DC和巨噬细胞的表型特征。
Abstract
肠道内居住的是参与对共生的植物和食物抗原在促进容忍，而随之而来的剩余准备安装的炎症反应，病原体侵入朝1,2先天免疫和适应性免疫细胞的独特群体。抗原提呈细胞，特别是区议会和巨噬细胞，发挥关键作用，在肠道免疫稳态维持通过自己的能力感和妥善应对微生物3-14。肠道DC和巨噬细胞的高效分离是在描述这些细胞的表型和功能的关键一步。虽然隔离肠道免疫细胞，包括区议会和巨噬细胞，许多有效的方法已6,10,15-24，许多依靠长期的消化时间，可能会产生负面影响细胞表面抗原的表达，细胞活力，和/或细胞产量。在这里，我们详细介绍快速分离的大量viabl的一种方法E，肠区议会和巨噬细胞。肠道DC和巨噬细胞的表型特征进行了直接染色孤立的肠细胞与特定的荧光标记单克隆抗体多色流式细胞仪分析。此外，高纯度的DC和巨噬细胞群体隔离功能的研究，利用CD11c和CD11b的磁激活细胞分选，细胞分选微珠。
Protocol
1。肠上皮细胞的解剖和离解
制备的试剂和设备：
- 温暖的Ca 2 + /镁2 +无PBS（CMF的PBS）的室温。
- 温暖的Ca 2 + / Mg 2 +的免费的HBSS 5％胎牛血清（CMF方案的HBSS / FBS），和2mM EDTA室温。
- 温暖的轨道摇床至37°C。
注：步骤1.1至1.7，必须尽快进行，以尽量减少细胞死亡的程度，并实现最大的细胞产量。
- 安乐死小鼠中的CO 2室及喷到腹部和胸部70％的乙醇。
- 让小剪刀和剥离皮肤暴露腹膜横切口在腹部中间。
- 从小肠上部进行分离胃幽门括约肌切割。戏弄了用钳子肠系膜和再次削减回肠盲肠的阀门释放整个小肠，大肠。使肛门边缘的切割和再次捉弄除了肠系膜，直到大肠是免费的。
- 剖开结肠，纵向用剪刀在CMF的PBS在室温下肠腔内粪便的内容和粘液洗掉。
- 用剪刀和镊子宏观剖析反肠系膜表面沿小肠Peyer氏斑和纵向剖开小肠。
- 在室温下洗小肠管腔粪便的内容和粘液在CMF的PBS。
- 分别含30毫升预热的CMF方案的HBSS /胎牛血清和2mM EDTA单独的50毫升锥形管小/大肠切成约1.5厘米的块和地方。不要添加超过50毫升锥形管的1％的小肠。
- 每50毫升锥形管水平放入轨道摇床和在250转摇在37°C <20分钟/ LI>
- 废物桶置于一个单一的铁丝网过滤，倒入每次50毫升锥形管的内容，通过收回1.5厘米的小肠件，并将其放置在独立50预的温暖CHBSS /胎牛血清30毫升含2毫升锥形管mM的EDTA。
- 重复1.8。
2。组织消化和肠细胞的分离
试剂和设备的准备：
- 胶原酶溶液： 1.5毫克/毫升的类型第八胶原酶溶解在CMF的HBSS中预温/胎牛血清与40微克/毫升的DNase I。
- CMF的HBSS中预温/胎牛血清和2mM EDTA。
- 预热的轨道摇床在37°C
- 冰冷的CMF方案的HBSS / FB的。
- 晃动的第二轮结束后，通过过滤网倒入每次50毫升锥形管的内容和转移1.5厘米的小肠一个小塑料件重量船后，涂抹了多余的介质，使用纸巾。
- 迅速切末1.5厘米小肠件重量船直接用剪刀和胶原酶溶液20毫升加入剁碎的小肠。每50毫升锥形管放入轨道摇床和消化水平在10-20分钟200转37°C. 请参见下面有关优化的讨论。
- 简要涡通过100μm的细胞过滤器，直接到50毫升锥形管，以确保任何剩余的肠道组织和过滤器的彻底分离。
- 关闭每50毫升锥形管的顶端与CMF方案的HBSS / FB和1500转离心5分钟，4°C。如果固体颗粒不离心后观察结肠样品，样品应为3.5分钟再次离心。再次重复此清洗步骤。
- 倒掉上清，重悬细胞沉淀在冰冷的CMF方案的HBSS / FBS和地方样本上冰。
- 进行流式细胞仪采集/分析或磁珠富集高速细胞sorti的第4条第3节纳克。
3。多色流区议会和巨噬细胞的流式细胞仪分析抗体染色
试剂和设备的准备：
- 冰冷CMF的PBS。
- 冰冷的染色缓冲（CMF的PBS + 5％FBS）。
- 准备在1:1000稀释死细胞染色，用活/死可修复水族死细胞染色试剂盒，在冰冷的CMF的PBS。
- 准备加入荧光标记单克隆抗体（mAb）冰冷的染色缓冲抗体染色鸡尾酒：CD45-PerCP，CD103-PE，CD11c的，APC，MHC-Ⅱ（执行机构）的Alexa Fluor 700，CD11b的eFluor 450，F4/80-PE-Cy7。
- 转移到5毫升的聚苯乙烯圆底（流式细胞仪）管细胞。
- 在冰冷的CMF的PBS洗涤细胞两次。
- 染色死细胞孵育15分钟就在黑暗中的冰。
- 在冰冷的CMF的PBS洗涤细胞两次。
- 2.4G2anti-FcγRIII/II座在冰冷的染色细胞在冰上10分钟的缓冲。
- 在冰冷的染色缓冲洗细胞。
- 孵育抗体染色鸡尾酒在黑暗中冰20分钟的样品。
- 与冰冷的染色缓冲洗细胞两次，并悬浮在400μl冰冷的染色缓冲区的样品，并通过流式细胞仪管40微米的过滤器盖。
- 收购上的LSR II流式细胞仪（BD）作为由浇注战略定义，在第5和图1的样品。
4。富集区议会和巨噬细胞从小肠
试剂和设备的准备：
- 冰冷的染色缓冲（CMF的PBS + 5％FBS）。
- 孵育根据制造商的指示，从步骤2.5以CD11b和CD11c磁珠珠获得单细胞悬液。
- 用离心缓冲区冰冷的染色细胞。
- 弃上清，悬浮细胞沉淀用1 mL冰冷的染色缓冲并通过细胞由40微米的细胞过滤过滤100微米。
- 磁珠连接细胞丰富，通过积极选择使用磁珠的LS磁列。
- 重复步骤4.2和弃上清。
- 孵育步骤3.7中所述的表面标记单克隆抗体的细胞。
- 洗两次磁珠富集细胞与冰冷的染色缓冲。重悬细胞沉淀，在500μL冰冷无叠氮化钠染色缓冲，并通过40微米的细胞过滤器传递到流式细胞仪管。
- 进行屋宇署唱腔二，细胞分选，排序肠道DC和/或利益的巨噬细胞亚群流式细胞仪分选。
5。浇注战略为LP装甲运兵车
注 ：请注意，未染色的肠细胞可能被利用作为阴性对照，以协助妥善安置门正面和负面的人群分开。
- 如图1，创建一个点图和排除细胞是死细胞染色（ 图1A），其次是排斥的双重事件（ 图1B和C）呈阳性反应。然后，根据转发侧分散决策一定要排除碎片（ 图1D）的利息细胞的大门。
- 创建另一个点的情节和CD45的进一步门+和IA B +细胞，表型特征装甲运兵车（ 图1E）。
- 在一个单独的点图，分析CD11b和CD11c的表达来区分特定的DC和巨噬细胞亚群（R1，R2和R3。图1F）。 R1的细胞素CD11c + CD11b的沉闷/ -细胞。地区，R2被划定为CD11c的，这些细胞有R1细胞表面表达水平相似，但R2细胞也表达CD11b的。此后，R3的地区被指定的细胞，细胞CD11b +和CD11c 沉闷/ - 。
- 一个alyze地区R1，R2和R3的进一步F4/80的和CD103表达分化巨噬细胞和DC人群，分别。在素CD11c + CD11b的沉闷/ - αE整合，CD103，F4/80的较低水平（ 图1G）R1的快递高水平的细胞。细胞CD11b + CD11c的+ R2的基于二元表达CD103和F4/80的（ 图1H）两个区议会和巨噬细胞组成的细胞。最后，细胞CD11b + CD11c的沉闷/ - R3的细胞构成基于表型剖面的F4/80的+和CD103的巨噬细胞- （ 图1I）16。
6。代表结果
图1。首先从分析中排除浇注战略肠道DC和巨噬细胞，死细胞（A）和双峰（B和C），然后小intestiNAL细胞门相应的转发和侧散射（四），装甲运兵车被定义为CD45的保险业监督B +（E）巨噬细胞和DC的CD11b和CD11c（F）的表达。 CD103细胞预门R1（七），R2（H）和R3（一）人口和F4/80的表达进行了分析。
图2。细胞产量和抗体染色的质量取决于消化时间。CD11b和CD11c的染色模式下（D）总细胞产量，最佳（乙，戊类）或过度消化（，F）的肠道组织。
从C57BL / 6小鼠小肠肠细胞的分离和区议会和巨噬细胞上的BD LSR II流式细胞仪分析。使用未染色和荧光染色脾设置电压和补偿。首先排除死细胞（ 图1A）和双峰（ 图1B和C）分析。感兴趣的细胞，然后根据转发和分析，其次对CD45的门侧散射（ 图1D）+和IA B +细胞（ 图1E）。此后，CD11b和CD11c的表达评估之间的CD45 +保险业监督B +细胞划定三个区域（R1，R2和R3。图1F）。评估，区议会和巨噬细胞之间的区分，分别在三个区域中CD103和F4/80的表达。在素CD11c + CD11b的沉闷/ - R1细胞表达高水平αE整合，CD103，F4/80的较低水平（ 图1G）。细胞CD11b + CD11c的+ R2的细胞组成的基于二元表达CD103和F4/80的（ 图1H）两个区议会和巨噬细胞，而细胞CD11b + CD11c的沉闷/ - R3的细胞构成/ F4的表型剖面的基础上的巨噬细胞80 +和CD103 - （
该组织总细胞产量和细胞CD11b和CD11c表达的消化时间之间的关系如图2所示。 3分钟消化（消化下）肠组织产生了较低的总细胞数（ 图2D），因此，很少的区议会和巨噬细胞的特性（ 图2A）。组织11分钟的消化产生了强劲的活细胞（ 图2E）产量与人口的区议会和巨噬细胞表达高水平的CD11b和CD11c和表型不同（ 图2C）。相比之下，在一个类似的细胞产量为50分钟（超过消化）消化导致当合作mpared优化消化（ 图2E和F），然而，划定不同的细胞，利用细胞CD11b和CD11c人口成为表达CD11c的减少更晦涩难懂（ 图2C）和死细胞数量增加（数据未显示）。
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Discussion
图3。直接组织消化时间的影响因素，重要的细胞产量和表面抗原表达的优化。细胞产量和表面抗原表达，胶原酶的具体特点，组织切碎程度，以及存在或炎症的情况下，这可能会影响组织的完整性和细胞结构。长期组织消化，可能会导致细胞活力下降和表面抗原的表达，同时组织消化不足可能会导致在分析细胞缺乏。
在这里，我们详细介绍了快速分离的小鼠肠道区议会和巨噬细胞的表型特性，使用多色流式细胞仪富集使用磁珠磁珠和细胞分选进行纯化细胞功能的研究方法。胶原酶浓度的优化并组织消化的时间是要产生一个强大的电池产量，不妥协的可行性和表面抗原表达。在消化产生一个低的细胞总数和区议会和巨噬细胞的特性缺乏（ 图2A和D）。另一方面，过度消化产生的总细胞数类似的优化条件下（ 图2F），但死细胞数量略微增加（数据未显示）和染色的质量就会大打折扣。类似消化下，组织的过度消化，将复杂的表型特征和净化。
考虑的一些额外的参数，使用此协议的制造商，类型和胶原酶，肠道的完整性和细胞结构的具体很多，和切碎的组织程度。作为胶原酶活性的变异之间可能存在着不同的制造商，胶原酶的类型，和生产劳TS，消化效力可能差别很大，需要优化。因此，选择最合适的类型胶原酶是至关重要的设计实验时，可能会影响数据的质量和可重复性。型胶原酶第八自Sigma-Aldrich获得在我们的经验，提供了最好的结果，但是，我们也有成功使用Sigma-Aldrich公司的胶原酶IV型。
虽然上面有详细的协议已被优化，对健康的小肠和大肠，它可以成功地用于隔离区议会和增加与炎症有关的细胞结构和建筑失真的巨噬细胞发炎组织的参展。肠道炎症的存在，可能极大地影响消化往往增加肠组织的灵敏度，以我们的经验为基础的蛋白水解酶的作用率。因此，消化或concentratio的时间胶原酶N必须相应的调整与炎症有关组织的完整性。
此外，切碎的组织程度，会影响组织的消化时间。切碎成小块的组织，增加消化表面积，产生更多的细胞，但应采取预防措施，组织可能更容易受到过度消化。因此，消化的时间可能需要降低。相比之下，穷人切碎，将导致较大的组织块，将消化不佳，导致在一个较低的总细胞产量。增加消化时间可能为穷人切碎，以在一定程度上弥补。
参数优化与肠组织胶原酶消化后，一个强大的电池产量可以迅速实现。因此，肠道DC和巨噬细胞群体可以更准确的特点和功能的研究评估因子纯化生产，抗原提呈和免疫细胞的调节。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢亚伦RAE（埃默里大学儿科和儿童医疗亚特兰大流核心），细胞分选。这项工作是由NIH资助AA01787001，从克隆氏病及溃疡性结肠炎美国基金会事业发展奖，和埃默里Egleston儿童研究中心种子批支持到顶级域名（TLD）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free | |||
| Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza Inc. | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| DNase I | Roche Group | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD Biosciences | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD Biosciences | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Biosciences | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD Biosciences | ||
| FACSAria II | BD Biosciences |
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