בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Summary

כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.

Abstract

בתוך המעי מתגוררים אוכלוסיות ייחודיות של תאים חיסוניים מולד אדפטיבית המעורבים בקידום הסובלנות כלפי פלורה commensal ו אנטיגנים מזון תוך במקביל צפוי להישאר לעלות תגובות דלקתיות כלפי ^1,2 פתוגנים פולשניים. תאים מציגי אנטיגן, במיוחד DCS ומקרופגים, ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הומאוסטזיס החיסון במעי באמצעות יכולתם לחוש כראוי להגיב החיידקים ^3-14. בידוד יעיל של DCS ומקרופגים מעיים הוא שלב קריטי לאפיון הפנוטיפ ותפקוד של תאים אלה. בעוד שיטות יעילות רבות של בידוד תאים חיסוניים מעיים, כולל DCS ומקרופגים, תוארו ^6,10,15-24, רבים מסתמכים על פי digestions ארוכים שעלולים להשפיע לרעה על שטח פני התא אנטיגן הביטוי, כדאיות התא, ו / או תשואה התא. כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של מספר רב של viabl, דואר DCS מעיים ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע ישירות על ידי מכתים תאים במערכת העיכול מבודדים עם ספציפיים נוגדנים חד שבטיים הקרינה, שכותרתו עבור ניתוח רב צבע זרימת cytometric. יתר על כן, DC טהור מאוד מקרופגים אוכלוסיות מבודדות ללימודי תפקודית ניצול CD11c ו CD11b מגנטי פעילה חרוזים סלולריים מיון ואחריו מיון התא.

Protocol

1. דיסקציה ודיסוציאציה בתאי האפיתל במעי

הכנת חומרים כימיים וציוד:

• חם Ca ^{2 +} / ^{2 +} Mg ללא PBS (CMF PBS) לטמפרטורת החדר.
• ע"א חם ^{2 +} / ² מ"ג ⁺ ללא HBSS עם FBS 5% (CMF HBSS / FBS) ו - 2 מ"מ EDTA לטמפרטורת החדר.
• חם Orbital שאכר אל 37 ° C.

הערה: צעדים 1.1 ל 1.7 יש לבצע מהר ככל האפשר כדי למזער את היקף מותם של תאים כדי להשיג תשואה מקסימלית התא.

1. להרדים עכברים בתא CO ₂ ואתנול ספריי 70% על הבטן ועל החזה.
2. לעשות חתך אופקי קטן באמצע הבטן עם מספריים לקלף בחזרה את העור לחשוף הצפק.
3. המשך להפריד בין הקיבה למעי הדק העליון על ידי חיתוך על הסוגר השוער. להקניט משם לפדר עם מלקחיים וחותכים שובשסתום ileo-cecal לשחרר את המעי הדק כולו מן המעי הגס. לעשות חתך על סף אנאלי ושוב ניסתה להפריד לפדר עד למעי הגס ללא תשלום.
4. חותכים לפתוח את המעי הגס longitudinally באמצעות מספריים לשטוף את התוכן צואה וריר של לומן המעי ב CMF PBS בטמפרטורת החדר.
5. השתמש מספריים מלקחיים כדי macroscopically לנתח את המדבקות של Peyer על פני השטח נגד mesenteric של המעי הדק ופצע פתוח המעי הדק longitudinally.
6. לשטוף את לומן המעי הדק של תוכן צואה וריר ב CMF PBS בטמפרטורת החדר.
7. בנפרד לחתוך את המעי קטן / גדול לתוך כ 1.5 ס"מ חתיכות ומניחים בתוך 50 צינורות נפרדים מ"ל חרוטי המכילים 30 מ"ל מחומם מראש CMF HBSS / FBS ו 2 מ"מ EDTA. אין להוסיף יותר מ 1 לכל צינור המעי מ"ל 50 חרוטי.
8. אופקית למקם כל צינור חרוטי 50 מ"ל לתוך שייקר מסלולית וללחוץ על סל"ד 250 על 20 דקות בשעה 37 ° C. </ Li>
9. מניחים מסננת אחת קווי מעל דלי פסולת ויוצקים את תוכן הצינור לכל קוני 50 מ"ל דרך לשחזר את חתיכות 1.5 ס"מ של המעי ומניחים אותם 50 צינורות נפרדים חרוטי מ"ל המכיל 30 מ"ל של טרום חוממו CHBSS / FBS עם 2 mM EDTA.
10. חזור על 1.8.

2. רקמת העיכול בידוד של תאים במערכת העיכול

ההכנות של חומרים כימיים וציוד:

• Collagenase פתרון: 1.5 מ"ג / מ"ל ​​סוג השמיני collagenase מומס מחומם מראש CMF HBSS / FBS עם 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​של DNase א
• מחומם מראש CMF HBSS / FBS ו 2 מ"מ EDTA.
• מחומם מראש מסלולית שייקר ב 37 ° C.
• קר כקרח CMF HBSS / FBS.

1. לאחר הסיבוב השני של רעד, לשפוך את תוכן הצינור לכל קוני 50 מ"ל דרך מסננת ולהעביר 1.5 ס"מ של המעי חתיכות פלסטיק קטן שוקל הספינה לאחר מספיגה משם התקשורת עודף באמצעות מגבת נייר.
2. במהירות בשר טחון 1.5 חתיכות ס"מ של המעי באמצעות מספריים ישירות הסירה משקל ולהוסיף המעי טחון ל 20 מ"ל של תמיסת collagenase. אופקית למקם כל צינור חרוטי 50 מ"ל לתוך שייקר מסלולית ולעכל בסל"ד 200 דקות 10-20 ב 37 ° C. ראה דיון בהמשך על אופטימיזציה.
3. מערבולת לזמן קצר על מנת להבטיח ניתוק יסודית של רקמות מסנן כל המעי הנותר דרך מסננת 100 מיקרומטר תא ישירות לתוך צינור מ"ל 50 חרוטי.
4. למעלה את הצינור בכל חרוטי 50 מ"ל עם CMF HBSS / FBS ו צנטריפוגות בסל"ד 1500 דקות 5 על 4 ° C. אם גלולה מוצקה לא ציין עבור דגימות המעי הגס לאחר צנטריפוגה, הדגימות יש centrifuged שוב דק '3.5. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
5. יוצקים את supernatant ו resuspend תא גלולה ב קר כקרח CMF HBSS / FBS דגימות קרח על המקום.
6. המשך לסעיף 3 לרכישת FACS / ניתוח או סעיף 4 להעשרת מגנטי חרוז עבור במהירות גבוהה התא sorting.

3. נוגדנים מכתים עבור ניתוח רב Flow צבע Cytometric של DCS ומקרופגים

ההכנות של חומרים כימיים וציוד:

• קר כקרח CMF PBS.
• קר כקרח מכתים חיץ (CMF PBS + 5% FBS).
• הכן את התא מת כתם על קר כקרח CMF PBS בדילול 1:1000 באמצעות LIVE / מת אפשר לתקן ערכת אקווה Cell המלח הכתם.
• להכין את הקוקטייל מכתים נוגדנים על ידי הוספת הבאים הקרינה, שכותרתו נוגדנים חד שבטיים (מבז) למאגר קפוא מכתים: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA ^B)-Alexa פלואוריד 700, CD11b eFluor-450, F4/80-PE-Cy7.

1. להעביר את התאים לתוך 5 מ"ל קלקר צינור (FACS) מסביב לתחתית.
2. לשטוף את התאים פעמיים קר כקרח CMF PBS.
3. דגימות דגירה עם תאים מתים כתם במשך 15 דקות על הקרח בחושך.
4. לשטוף את התאים פעמיים קר כקרח CMF PBS.
5. בלוק תאים עם anti-FcγRIII/II 2.4G2 ב מכתים קר כקרחמאגר של 10 דקות על הקרח.
6. לשטוף את התאים במאגר קר כקרח מכתים.
7. דגירה דגימות עם קוקטייל נוגדנים מכתים עבור 20 דקות על הקרח בחושך.
8. לשטוף את התאים עם חיץ קפוא מכתים פעמיים resuspend דגימות μl 400 מאגר קפוא מכתים ולעבור שווי 40 מיקרומטר מסנן על צינורות FACS.
9. להשיג דגימות על LSR II cytometer (BD) כפי שהוגדרו על ידי אסטרטגיה gating בסעיף 5, איור 1.

4. העשרת DCS ומקרופגים מהמעי

ההכנות של חומרים כימיים וציוד:

• קר כקרח מכתים חיץ (CMF PBS + 5% FBS).

1. דגירה ההשעיה תא בודד המתקבל צעד 2.5 עם CD11b ו CD11c חרוזים מחשבי Mac פי הוראות היצרן.
2. לשטוף את התאים עם חיץ קר כקרח מכתים ואחריו צנטריפוגה.
3. מחק supernatant ו resuspend תא גלולה במאגר 1 קר כקרח מכתים מ"לולעבור מסננת 100 מיקרומטר התא ואחריו מסננת תא 40 מיקרומטר.
4. להעשיר את החרוז-מצורפים תאים מגנטיים ידי סלקציה חיובית באמצעות MACS טור LS מגנטי.
5. חזור על שלב 4.2 וזורקים supernatant.
6. דגירה תאים עם סמן מבז השטח כפי שמתואר בשלב 3.7.
7. לשטוף מגנטיים חרוז, מועשר בתאי פעמיים עם חיץ קר כקרח מכתים. Resuspend כדורי סלולריים במאגר 500 קר כקרח μL מכתים ללא אזיד הנתרן, ומעבירים דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור FACS.
8. המשך FACS-מיון על סדרן ARIA II תא BD למיין DC המעי ו / או תת מקרופאג של עניין.

5. Gating אסטרטגיה LP נגמ"שים

הערה: שימו לב, תאים במערכת העיכול בלא כתם עשוי להיות מנוצל כביקורת שלילית לסייע מיקום נכון של השערים להפריד בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות.

1. כפי שניתן לראות בתרשים1, ליצור עלילה נקודה לא לכלול תאים חיוביים עבור התא מת הכתם (איור 1 א) ואחריו למעט אירועים חולצה מהודקת (איור 1B ו-C). לאחר מכן, השער על תאים של עניין על פי קדימה פיזור בצד לוודא להוציא פסולת (1D איור).
2. ליצור עוד עלילה נקודה ושער נוסף על CD45 ^{+ ו-IA-B +} תאים, אשר phenotypically המאפיינת נגמ"שים 1E (איור).
3. על מגרש נקודה נפרדת, לנתח עבור CD11b וביטוי CD11c להבחין DC ספציפיים תת מקרופאג (R1, R2 ו R3;. איור 1F). תאים של R1 הם CD11c ⁺ CD11b ^{משעממים / -} תאים. האזור, R2, מותווה כך התאים הללו יש רמות דומות של הבעת פני השטח של CD11c כמו תאים של R1 אבל גם תאים של R2 Express CD11b. לאחר מכן, באזור R3 מיועד תאים שאינם ⁺ CD11b ו CD11c ^{משעמם / -.}
4. alyze אזורים R1, R2, וביטוי נוסף על F4/80 ו CD103 R3 להבדיל מקרופאג ואוכלוסיות DC, בהתאמה. CD11c ⁺ CD11b ^{משעמם / -} תאים של רמות גבוהות של R1 אקספרס integrin αE, CD103, ורמות נמוכות של F4/80 (איור 1G). CD11b ^{+ +} CD11c תאים של R2 מורכבים משני DCS ומקרופגים המבוססים על ביטוי דיכוטומי שלהם CD103 ו F4/80 (איור 1H). לבסוף, CD11b ⁺ CD11c ^{משעממים / -} תאים של מקרופאגים R3 מהווים בסיס פרופיל פנוטיפי של F4/80 ⁺ ו-CD103 ^- (איור 1i) ^16.

6. נציג תוצאות

באיור 1. האסטרטגיה gating עבור DCS ומקרופגים מעיים. תאים מתים () ו כפילויות (B ו-C) לא נכללו 1 מתוך ניתוח ולאחר מכן intesti קטןתאים NAL היו מגודרת בהתאם קדימה לצד פיזור (ד '), ונגמ"שים הוגדרו CD45 ⁺ IA ^{B +} (ה). מקרופאגים ו DCS זוהו על ידי ביטוי של CD11b ו CD11c (F). CD103 ו F4/80 ביטוי תאים טרום מגודרת על R1 (G), R2 (ג) ו R3 (אני) אוכלוסיות נותח.

איור 2. התשואה התא מכתים איכות נוגדנים תלוי בזמן העיכול. CD11b דפוס מכתים CD11c תשואה התא הכולל של תת (A, D), בצורה אופטימלית, (B, E) או מעל מתעכל (C, F) רקמת המעי.

תאים במערכת העיכול נותקו מן המעי קטן C57BL / 6 העכבר DCS ומקרופגים נותחו על ידי FACS על LSR BD השנייה. מתח הפיצוי נקבעו באמצעות בלא כתם חד fluorochrome המוכתמים splenocytes. תאים מתים (איור 1 א) ו כפילויות (איור 1 ב 'וג') לא נכללו 1 מניתוח. תאים של עניין ולאחר מכן נותחו על פי קדימה לצד פיזור (איור 1D) ואחריו gating על CD45 ⁺ ו-IA ^{ב +} תאים (איור 1E). לאחר מכן, CD11b וביטוי CD11c הוערך בין CD45 ⁺ IA ^{B +} תאים להתוות שלושה אזורים (R1, R2 ו R3;. איור 1F). CD103 ו F4/80 ביטוי בשלושת האזורים הוערך להבחין בין DCS ומקרופגים, בהתאמה. CD11c ^{+ / משעמם} CD11b ^- תאים של R1 הביעו רמות גבוהות של integrin αE, CD103, ורמות נמוכות של F4/80 (איור 1G). CD11b ^{+ +} CD11c תאים של R2 הורכבו שני DCS ומקרופגים המבוססים על ביטוי דיכוטומי שלהם CD103 ו F4/80 (איור 1H) תוך CD11b ⁺ CD11c ^{משעממים / -} תאים של מקרופאגים R3 מהווים בסיס פרופיל פנוטיפי של F4 / 80 ⁺ ו CD103 ^- ( 16. מקרופאגים בתוך השער R2 ומקרופגים בשער R3 יש קדימה דומה ולפזר תכונות לוואי והם להבחין ידי ביטוי CD11c. הדיכוטומיה פונקציונלי של תת קבוצות אלה עדיין מובנת.

הקשר בין משך הזמן של עיכול רקמות על התשואה התא הכולל את הביטוי של CD11b ו CD11c מתוארת באיור 2. רקמת המעי אשר מתעכל דקות 3 (תת מערכת העיכול) הניב התא נמוכה המספר הכולל (איור 2 ד) ו - DCS ספורים ובכך ומקרופגים זמינים לאפיון (איור 2 א). עיכול רקמת דקות 11 המיוצר על תשואה יציבה של תאים חיים (2E איור) עם אוכלוסיות של DCS ומקרופגים שהביעו רמות גבוהות של CD11b ו CD11c והיו ברורים phenotypically (איור 2 ג). לעומת זאת, עיכול דקות 50 (יתר מערכת העיכול) הביא תשואה התא דומה כאשר שיתוףmpared לעיכול אופטימלי (2E F איור ו), עם זאת, סימון של אוכלוסיות תאים שונות באמצעות CD11b ו CD11c הפך מעורפל יותר כביטוי של פחתה CD11c (איור 2 ג) ואת מספר התאים המתים גדל (מידע לא מוצג).

Discussion

איור 3. גורמים חשובים עבור אופטימיזציה של התשואה התא אנטיגן ביטוי על פני השטח. תשואה תא אנטיגן ביטוי פני מושפעים ישירות על ידי כל תקופת עיכול רקמות, המאפיינים הספציפיים של collagenase, תואר של רקמות מיותרות, ונוכחות או העדר דלקת, אשר עשויים להשפיע על שלמות רקמות cellularity. עיכול רקמת ממושך עלול לגרום כדאיות התא ירד אנטיגן ביטוי פני השטח תוך כדי עיכול רקמות מספקת עלולה לגרום מיעוט של תאים לניתוח.

כאן, אנו מפורט מתודולוגיה בידוד מהיר של DCS עכבר ומקרופגים מעיים לאפיון פנוטיפי שימוש רב בצבע cytometry זרימה להעשרת באמצעות מחשבי Mac חרוזים סלולריים המיון לבצע מחקרים תפקודית על מטוהרים תאים. אופטימיזציה של ריכוז collagenaseואת משך הזמן של עיכול רקמות יש צורך לייצר תשואה תא חזקים מבלי להתפשר על יכולת הקיום ועל אנטיגן ביטוי על פני השטח. תת העיכול מניב מספר נמוך התא הכולל מיעוט DCS ומקרופגים לאפיון (איור 2 א ו ד). מצד שני, יתר העיכול מניב מספר הנייד הכולל דומה לתנאים אופטימיזציה (איור 2F) אבל מספר התאים המתים גדל במידה ניכרת (מידע לא מוצג) ואיכות מכתים נפגעת. בדומה העיכול, תחת, מעל עיכול של רקמת היה לסבך את אפיון פנוטיפי טיהור ו.

מספר פרמטרים נוספים בתמורה בפרוטוקול זה הם, יצרנית סוג מסוים של הרבה collagenase, יושר cellularity של המעי, ומידת רקמות מתייפייף. כמו השתנות בפעילות collagenase יכולה להתקיים בין יצרנים שונים, סוגי collagenase, והנה הייצורTS, העוצמה של מערכת העיכול יכולה להשתנות באופן משמעותי ומחייב אופטימיזציה. לפיכך, הבחירה של סוג המתאימה ביותר של collagenase היא קריטית בעת תכנון הניסוי כמו איכות שחזור הנתונים עלולה להיפגע. מניסיוננו, collagenase סוג השמיני לקבל Sigma-Aldrich סיפקה את התוצאות הטובות ביותר, עם זאת, יש לנו גם הצלחה באמצעות collagenase סוג ד 'מ Sigma-Aldrich.

בעוד פרוטוקול מפורט לעיל כבר מותאם לשימוש על המעיים קטנים וגדולים בריאים, ניתן להשתמש בו בהצלחה על בידוד של DCS ומקרופגים מן הרקמה הדלקתית המציגים cellularity מוגברת עיוות ארכיטקטוני קשור לדלקת. נוכחות של דלקת המעי עשוי להשפיע באופן דרמטי את קצב העיכול, בדרך כלל להגדיל את הרגישות של רקמת המעי לפעילות של אנזימים פרוטאוליטים בהתבסס על הניסיון שלנו. לכן, את משך הזמן של עיכול או concentration של collagenase צריך להיות מותאם בהתאם לשינויים שלמות רקמות הקשורים לדלקת.

יתר על כן, מידת רקמת וקוצצים ישפיע על משך הזמן של עיכול רקמות. רקמת ממינסינג לחתיכות קטנות יותר מגדיל את שטח הפנים לעיכול והתשואות יותר תאים אבל אמצעי זהירות יש לנקוט, כמו רקמת עשויים להיות רגישים יותר לעיכול יתר. כתוצאה מכך, משך הזמן של עיכול ייתכן שיש ירידה. לעומת זאת, מגונדרת עניים תגרום חתיכות גדולות יותר של רקמות אשר לעכל כהלכה וכתוצאה מכך התשואה התא נמוכה בסך הכל. הגדלת משך הזמן של עיכול יכול לפצות על וקוצצים עניים במידה מסוימת.

על אופטימיזציה של הפרמטרים לעיכול רקמת המעי עם collagenase, התשואה תא חזקים יכולה להיות מושגת במהירות. כתוצאה מכך, DC המעי אוכלוסיות מקרופאג ניתן לאפיין בצורה מדויקת יותר מטוהרים ללימודי תפקודית להעריך ציטוקיניםהייצור, מצגת אנטיגן, ועל תקנה של תאים חיסוניים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free
Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red	Fisher Scientific	SH3001603
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
1M HEPES in 0.85% NaCl	Lonza Inc.	17-737E
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H	Heat-inactivated
0.5M EDTA (pH 8.0)	Cellgro	46-034-CI
Collagenase type VIII	Sigma-Aldrich	C2139
DNase I	Roche Group	14785000	Stock solution: 100mg/ml
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation	Invitrogen	L34957	Use at 1:1000
CD45-PerCP mAb (30F11)	BD Biosciences	557235	Use at 1:100
CD103-PE mAb (M290)	BD Biosciences	557495	Use at 1:100
FcγRIII/II mAb (2.4G2)	BD Biosciences	553141	Use at 1:200
CD11c-APC mAb (N418)	eBioscience	17-0114-82	Use at 1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb	eBioscience	56-5321-82	Use at 1:100
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70)	eBioscience	48-0112-82	Use at 1:200
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8)	eBioscience	25-4801-82
CD11b microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-601
CD11c microbeads	Miltenyi Biotec	130-052-001
50 mL conical tubes	BD Biosciences	352098
Single mesh wire strainer	Chefmate
Small weigh boat	Fisher Scientific	08-732-116
100 μm cell strainer	BD Biosciences	352360
40 μm cell strainer	BD Biosciences	352340
5 mL polystyrene round-bottom tubes	BD Biosciences	352235	Use at 1:100
MaxQ 4450 benchtop orbital shaker	Thermo Fisher Scientific, Inc.
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSR II	BD Biosciences
FACSAria II	BD Biosciences