Summary
Her har vi detalje en metode til hurtig isolering af muse intestinale dendritiske celler (DCS) og makrofager. Fænotypisk karakterisering af intestinale DC'er og makrofager udføres under anvendelse af flerfarvede flowcytometrisk analyse under magnetisk perle tilsætning efterfulgt af cellesortering anvendes til opnåelse af særdeles rene populationer til funktionelle undersøgelser.
Abstract
Inden for tarmen opholder unikke bestande af medfødte og adaptive immunceller, der er involveret i at fremme tolerance over for kommensale flora og fødevarer antigener, mens samtidig de resterende klar til at montere inflammatoriske reaktioner mod invasive patogener 1,2. Antigenpræsenterende celler, især DC'er og makrofager, spiller kritiske roller i opretholdelsen intestinal immun homøostase via deres evne til sense og passende reagere mikrobiota 3-14. Effektiv isolering af intestinale DC'er og makrofager, er et kritisk trin i karakterisere fænotypen og funktion af disse celler. Mens mange effektive metoder til isolering af intestinale immunceller, herunder DC'er og makrofager, er blevet beskrevet 6,10,15-24 mange stole på lange fordøjelser gange kan negativt påvirke celleoverfladeantigen ekspression, cellelevedygtighed og / eller celleudbytte. Her har vi detaljeret en metode til hurtig isolering af et stort antal viable, intestinale DC'er og makrofager. Fænotypisk karakterisering af intestinale DC'er og makrofager udføres ved direkte farvning isolerede intestinale celler med specifikke fluorescens-mærkede monoklonale antistoffer for flerfarvede flowcytometrisk analyse. Desuden er meget ren DC-og makrofaglinjer populationer isoleret til funktionelle undersøgelser under anvendelse af CD11c og CD11b magnetisk cellesortering perler efterfulgt af cellesortering.
Protocol
1. Dissektion og dissociering af intestinale epitelceller
Fremstilling af reagenser og udstyr:
- Varm Ca2 + / Mg2 +-fri PBS (CMF PBS) til stuetemperatur.
- Varm Ca2 + / Mg2 +-fri HBSS med 5% FBS (CMF HBSS / FBS) og 2 mM EDTA til stuetemperatur.
- Varm orbitalryster til 37 ° C.
Bemærk: Trin 1,1 til 1,7 skal udføres så hurtigt som muligt for at minimere omfanget af celledød og for at opnå maksimal celleudbytte.
- Aflive mus i en CO 2 kammer og spray 70% ethanol på abdomen og thorax.
- Foretage en lille vandret snit i midten af maven med en saks og skrælle huden for at blotlægge peritoneum.
- Videre at adskille maven fra den øvre tyndtarm ved at skære ved pylorus sphincter. Driller væk mesenteriet med pincet og skåret igenDen ileo-caecal ventil for at frigøre hele tyndtarmen fra tyktarmen. Lave et snit i den anale rand og igen drille hinanden mesenterium indtil tyktarmen er fri.
- Skar colon længderetningen ved hjælp af sakse og vaskes af fækale indhold og slim fra tarmens lumen i CMF PBS ved stuetemperatur.
- Saks og pincet til makroskopisk dissekere ud Peyerske plaques langs anti-mesenteriske overflade af tyndtarmen og skåret åbne tyndtarmen længderetningen.
- Vask tyndtarmen lumen af fækalt indhold og slim i CMF PBS ved stuetemperatur.
- Separat skåret i små / tyktarmen i ca 1,5 cm stykker og anbringes i separate 50 ml koniske rør indeholdende 30 ml forvarmet CMF HBSS / FBS og 2 mM EDTA. Må ikke tilføje mere end 1 tarmen pr 50 ml konisk rør.
- Vandret placere hver 50 ml konisk rør på en orbitalryster og omrystes i ved 250 rpm i 20 minutter ved 37 ° C. </ Li>
- Placer et enkelt mesh wire si over en spild spand og hælde indholdet af hver 50 ml konisk rør gennem at inddrive de 1,5 cm stykker af tarmen og placere dem i separate 50 ml koniske rør, der indeholder 30 ml forvarmet CHBSS / FBS med 2 mM EDTA.
- Gentage 1,8.
2. Vævsfordøjelse og isolering af intestinale celler
Tilberedninger af reagenser og udstyr:
- Collagenaseopløsning: 1,5 mg / ml Type VIII Collagenase opløst i foropvarmede CMF HBSS / FBS med 40 ug / ml DNase I.
- Foropvarmede CMF HBSS / FBS og 2 mM EDTA.
- Foropvarmede orbitalryster ved 37 ° C.
- Iskold CMF HBSS / FBS.
- Efter den anden runde af rystelser, hælde indholdet af hver 50 ml konisk rør gennem sien og overføre 1,5 cm stykker af tarmen til en lille plastik vejer båd efter duppe væk overskydende medie ved hjælp af en køkkenrulle.
- Hurtigt hakke af en.5 Cm stykker af tarmen med en saks direkte i vægt båden og tilføje hakket tarmen til 20 ml collagenase opløsning. Vandret placere hver 50 ml konisk rør på en orbital omryster og fordøjelse ved 200 rpm i 10-20 min ved 37 ° C. Se diskussionen nedenfor vedrørende optimering.
- Kortvarigt vortex for at sikre grundig dissociation af resterende tarmvæv og filtreres gennem en 100 um cellefilter direkte i et 50 ml konisk rør.
- Låget hver 50 ml konisk rør med CMF HBSS / FBS og centrifugeres ved 1500 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Hvis en fast pellet ikke observeret colon prøver efter centrifugering, skal prøverne centrifugeret igen i 3,5 min. Gentage dette vasketrin gang mere.
- Hæld supernatanten og resuspender cellepelleten i iskold CMF HBSS / FBS og placere prøverne på is.
- Fortsæt til afsnit 3 for FACS køb / analyse eller § 4 for magnetisk-perle berigelse for højhastigheds-celle sorting.
3. Antistoffarvning for Multi-Color Flowcytometrisk analyse af udviklingslandenes og makrofager
Tilberedninger af reagenser og udstyr:
- Iskold CMF PBS.
- Iskold farvningsbuffer (CMF PBS + 5% FBS).
- Forbered døde celle pletten i iskoldt CMF PBS ved 1:1000 fortynding med LIVE / DEAD fixable Aqua Dead Cell Stain Kit.
- Klargør antistoffarvning cocktail ved tilsætning af følgende fluorescens-mærkede monoklonale antistoffer (mAb'er) til iskold farvningsbuffer: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA b)-Alexa Fluor 700, CD11b -eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.
- Overfør celler i en 5 ml polystyren rundbundet (FACS) rør.
- Vask cellerne to gange i iskold CMF PBS.
- Inkuber prøver med døde hudceller farves i 15 minutter på is i mørke.
- Vask cellerne to gange i iskold CMF PBS.
- Bloker celler med 2.4G2 anti-FcγRIII/II i iskoldt farvningbuffer i 10 min på is.
- Vask cellerne i iskold farvningsbuffer.
- Inkuber prøver med antistoffarvning cocktail i 20 minutter på is i mørke.
- Vask cellerne med iskold farvningsbuffer to gange og resuspenderes prøver i 400 pi iskold farvning puffer og passere gennem 40 um filter hætten FACS-rør.
- Anskaf prøver på LSR II cytometer (BD) som defineret af gating-strategi i afsnit 5 og figur 1.
4. Berigelse af DC'er og makrofager fra tarmen
Tilberedninger af reagenser og udstyr:
- Iskold farvningsbuffer (CMF PBS + 5% FBS).
- Inkuber enkelt cellesuspension blev opnået i trin 2.5 med CD11b og CD11c MLA perlerne ifølge producentens instruktioner.
- Vask cellerne med iskold farvning buffer efterfulgt af centrifugering.
- Supernatanten kasseres, og resuspenderes cellebundfaldet i 1 ml iskold farvningsbufferog passerer gennem en 100 um cellefilter efterfulgt af en 40 um cellefilter.
- Berige for magnetiske perle-bundne celler ved positiv selektion under anvendelse MACS LS magnetisk søjle.
- Gentage trin 4.2 og kassér supernatanten.
- Cellerne inkuberes med overflademarkør mAb'er som beskrevet i trin 3.7.
- Vask magnetiske perle-berigede celler to gange med iskold farvningsbuffer. Resuspender cellepellets i 500 uL iskold farvning buffer uden natriumazid og passere gennem 40 um cellefilter i et FACS-rør.
- Fortsæt til FACS-sortering på BD ARIA II Cell Sorter at sortere tarm DC og / eller makrofag delmængder af interesse.
5. Gating Strategi for LP APC'erne
Bemærk: Bemærk, at ufarvede intestinale celler kan anvendes som en negativ kontrol for at hjælpe med korrekt placering af portene for at adskille positive og negative populationer.
- Som vist i figur1, skaber et dot plot og udelukke celler, som er positive for døde celler farvning (fig. 1A) efterfulgt af udelukkelsen af dublet hændelser (Fig. 1B og C). Derefter gate på cellerne af interesse ifølge sende og sidespredning sørge for at udelukke urenheder (fig. 1D).
- Opret en anden dot plot og videre porten på CD45 + og IA b + celler, som fænotypisk præger APC'er (fig. 1E).
- På en separat punktdiagram, analysere for CD11b og CD11c ekspression til at skelne specifik DC og makrofag delmængder (R1, R2 og R3. Figur 1F). Celler af R1 er CD11c + CD11 b sløve / - celler. Regionen, R2 er afgrænset således at disse celler har tilsvarende niveauer af overfladeekspression af CD11 c, som i celler af R1, men celler af R2 også udtrykker CD11 b. Derefter bliver R3 region udpeget til celler, der er CD11b + og CD11c mat / -.
- Enalyze regioner R1, R2 og R3 i yderligere F4/80 og CD103 ekspressionen at differentiere makrofag-og DC populationer, hhv. Den CD11c + CD11b mat / - celler af R1 udtrykker høje niveauer af αE integrin, CD103, og lave niveauer af F4/80 (fig. 1G). CD11b + CD11c + celler R2 er sammensat af både DC'er og makrofager ud fra deres dikotome ekspression af CD103 og F4/80 (fig. 1 H). Endelig CD11b + CD11 c sløve / - celler af R3 er makrofager baseret på den fænotypiske profil F4/80 + og CD103 - (fig. 1I) 16.
6. Repræsentative resultater
Figur 1. Gating strategi for intestinale DC'er og makrofager. Døde celler (A) og dubletter (B og C) blev først udelukket fra analysen, og derefter mindre intestinale celler var gatet tilsvarende at sende og sidespredning (D), og APC'er blev defineret som CD45 + IA b + (E). Makrofager og DC'er blev identificeret ved ekspression af CD11b og CD11c (F). CD103 og F4/80 udtryk for celler før gated på R1 (G), R2 (H) og R3 (I) populationer blev analyseret.
Figur 2. Celleudbytte og antistoffarvning kvalitet afhænger fordøjelse tiden. CD11b og CD11c farvningsmønster og total celleudbytte på under-(A, D), optimalt-(B, E) eller over-fordøjet (C, F) tarmvæv.
Intestinale celler blev isoleret fra en C57BL / 6 mus tyndtarmen og DCS og makrofager blev analyseret ved FACS på BD LSR II. Spænding og erstatning blev sat med ufarvede og enkelt fluorokrom-farvede splenocyter. Døde celler (fig. 1A) og dubletter (Fig. 1B og C) blev først udelukket fraanalysen. Celler af interesse blev derefter analyseret efter at sende og sidespredning (Fig. 1D) efterfulgt af gating på CD45 + og IA b +-celler (fig. 1E). Derefter blev CD11b og CD11c ekspression vurderes af CD45 + IA b +-celler til at afgrænse tre regioner (R1, R2 og R3. Figur 1F). CD103 og F4/80 ekspression i de tre regioner blev vurderet til at skelne mellem DC'er og makrofager, hhv. Den CD11c + CD11b mat / - celler af R1 udtrykte høje niveauer af αE integrin, CD103, og lave niveauer af F4/80 (fig. 1G). CD11b + CD11c +-celler i R2 er sammensat af både DC'er og makrofager ud fra deres dikotome ekspression af CD103 og F4/80 (fig. 1 H), mens CD11 b + CD11c sløve / - celler af R3 er makrofager baseret på den fænotypiske profil F4 / 80 + og CD103 - (
Forholdet mellem varigheden af vævsfordøjelse på den totale celleudbytte og ekspressionen af CD11b og CD11c er illustreret i figur 2. Tarmvæv der blev fordøjet i 3 minutter (under-fordøjelse) gav lave samlede celleantal (fig. 2D) og derved få DC'er og makrofager til rådighed for karakterisering (fig. 2A). Vævsfordøjelse i 11 minutter frembragte en robust udbytte af levende celler (Fig. 2E) med populationer af DC'er og makrofager, der udtrykte høje niveauer af CD11b og CD11c og var fænotypisk adskilt (fig. 2C). I modsætning hertil resulterede fordøjelsen i 50 minutter (over-fordøjelse) på en lignende celleudbytte når compared til optimeret fordøjelse (fig. 2E og F), men afgrænsning af forskellige cellepopulationer ved hjælp CD11b og CD11c blev mere uklar, som udtrykker CD11 c formindsket (fig. 2C) og antallet af døde celler forøget (data ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Figur 3. Faktorer, der er vigtige for optimering af celle udbytte og overfladeantigen udtryk. Celleudbytte og overfladeantigen udtryk er direkte berørt af varigheden af væv fordøjelsen, de særlige karakteristika kollagenase, graden af væv hakkes og tilstedeværelse eller fravær af inflammation, der kan påvirke vævs integritet og cellularitet. Langvarig vævsfordøjelse kan resultere i nedsat cellelevedygtighed og overfladeantigen ekspression, mens utilstrækkelig vævsfordøjelse kan resultere i en mangel på celler til analyse.
Her har vi beskrevet en metode til hurtig isolering af mus tarm DC'er og makrofager til fænotypisk karakterisering ved hjælp af multi-farve-flowcytometri og for berigelse med MLA perler og cellesortering at udføre funktionelle undersøgelser på oprensede celler. Optimere koncentrationen af collagenaseog varigheden af vævsfordøjelse er nødvendig for at frembringe en robust celleudbytte uden at kompromittere levedygtighed og overfladeantigen-ekspression. Under-fordøjelse giver et lavt totalt celleantal og en mangel på DC'er og makrofager til karakterisering (fig. 2A og D). På den anden side giver over-fordøjelse et totalt celleantal lignende optimerede betingelser (fig. 2F), men antallet af døde celler mærkbart forøget (data ikke vist), og kvaliteten af farvningen er kompromitteret. Svarende til under-fordøjelse ville over-fordøjelse af væv komplicere fænotypisk karakterisering og oprensning.
Flere yderligere parametre for behandling ved hjælp af denne protokol er fabrikanten type og bestemt parti collagenase, integritet og cellularitet af tarmen, og graden af væv hakning. Som variation i collagenaseaktivitet aktivitet kan eksistere mellem forskellige producenter, typer af kollagenase og produktion lots, styrken af fordøjelse kan variere meget og kræver optimering. Derfor, valg af den mest hensigtsmæssige type af kollagenase er kritisk, når designe et eksperiment som kvaliteten og reproducerbarheden af de data, der kan blive påvirket. Det er vores erfaring, har collagenase type VIII fra Sigma-Aldrich forudsat de bedste resultater, men vi har også haft succes med kollagenase type IV fra Sigma-Aldrich.
Selv om den ovenfor detaljeret protokol er blevet optimeret til anvendelse på sunde tynd-og tyktarmen, kan det med held anvendes til isolering af DC'er og makrofager fra betændt væv udviser forøget cellularitet og arkitektoniske forvrængning forbundet med inflammation. Tilstedeværelsen af intestinal inflammation, kan dramatisk påvirke hastigheden af nedbrydning som ofte forøge følsomheden af intestinalt væv for virkningen af proteolytiske enzymer er baseret på vores erfaring. Derfor er varigheden af fordøjelse eller concentration af collagenase skal tilpasses i overensstemmelse med ændringer i vævsintegritet associeret med inflammation.
Endvidere vil graden af hakningen vævet påvirker varigheden af vævsfordøjelse. Hakkes vævet i mindre stykker forøger overfladearealet for fordøjelse og giver flere celler, men der skal tages forholdsregler, da væv kan være mere modtagelige for over-fordøjelse. Følgelig kan varigheden af fordøjelse skal reduceres. I modsætning hertil vil dårlig hakning resultere i større stykker af væv, som vil fordøje dårligt resulterer i et lavt totalt celleudbytte. At forøge varigheden af fordøjelse kan kompensere for dårlig hakning til en vis grad.
Ved optimering af parametrene for tarmvæv fordøjelse med collagenase, kan en robust celleudbytte hurtigt opnås. Som et resultat heraf kan intestinal DC og makrofag populationer mere nøjagtigt karakteriseres og oprenset til funktionelle undersøgelser for at vurdere cytokinproduktion, antigen præsentation, og reguleringen af immunceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Aaron Rae (Emory University Department of Pediatrics og børns Healthcare af Atlanta Flow Core) for cellesortering. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud AA01787001, en karriereudvikling Award fra Crohns og Colitis Foundation of America, og en Emory-Egleston Børns Research Center seed-støtte til TLD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free | |||
| Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza Inc. | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| DNase I | Roche Group | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD Biosciences | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD Biosciences | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Biosciences | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD Biosciences | ||
| FACSAria II | BD Biosciences |
References
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).
- Abraham, C., Medzhitov, R. Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).
- Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G.
- Rescigno, M.
- Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation. J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).
- Coombes, J. L., Powrie, F. Dendritic cells in intestinal immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).
- Kelsall, B. Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages. Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).
- Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).
- Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses. Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).
- Niess, J. H. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. How do DCs interact with intestinal antigens. Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).
- Bilsborough, J., Viney, J. L. Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease. Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).
- Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 52, 1522-1529 (2003).
- Medina-Contreras, O. CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice. J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).
- Denning, T. L. Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization. J. Immunol. , 187-733 (2011).
- Kim, Y. G. The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes. Immunity. 34, 769-780 (2011).
- Schulz, O. Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions. J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).
- Jaensson, E. Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans. J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).
- Uematsu, S. Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5. Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).
- Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).
- Sun, C. M. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).
- Kamada, N. Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria. J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).
- Denning, T. L. CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC. J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).
