Summary
Ileo postoperatorio (POI) è una complicanza della chirurgia addominale che porta a un aumento della morbilità e degenza prolungata. Poiché le strategie profilattiche o terapeutiche mancano intensificazione della ricerca è necessaria. Pertanto abbiamo stabilito un modello di topo standardizzata e possibile esaminare la fisiopatologia di POI e di studiare i potenziali opzioni terapeutiche.
Abstract
Infiammazione del tratto gastrointestinale è un motivo comune per una varietà di malattie umane. Modelli di ricerca animali sono fondamentali per indagare il complesso cellulare e molecolare della patologia intestinale. Anche se la tunica mucosa è spesso l'organo di interesse in molte malattie infiammatorie, opere recenti hanno dimostrato che il externa muscolare (ME) è un organo altamente immunocompetente che ospita una fitta rete di immunociti residenti. 1,2 Questi lavori sono stati eseguiti all'interno del standardizzato modello di manipolazione intestinale (IM) che porta a infiammazione della parete intestinale, essenzialmente limitata al ME. Clinicamente questa infiammazione porta a disturbi della motilità intestinale prolungato, nota come ileo postoperatorio (POI) che è una complicazione frequente e inevitabile dopo chirurgia addominale. 3 L'infiammazione è caratterizzata dalla liberazione di mediatori proinfiammatori quali IL-6 4 neurotrasmettitori o IL-1β o inibitorio come Nitric ossido (NO). 5 Successivamente, i numeri enormi di immunociti travasare nel ME, dominato dai neutrofili polimorfonucleati (PMN) e monociti e, infine, mantenere POI. duraturo, giorni 2, questa paralisi intestinale porta ad un aumento del rischio di aspirazione, traslocazione batterica e complicanze infettive fino a sepsi e insufficienza d'organo multi e provoca un elevato onere economico 6.
In questo manoscritto si dimostra il modello standardizzato di IM e di valutazione in vivo del transito gastrointestinale (GIT) e transito intestinale. Inoltre si dimostra un metodo per la separazione della ME dalla tunica mucosa seguita da analisi immunologiche, che è fondamentale distinguere tra le risposte infiammatorie in questi due compartimenti intestinali altamente immunoactive parete. Tutte le analisi sono facilmente trasferibili ad altri modelli di ricerca, che influenzano la funzione gastrointestinale.
Protocol
1. Animali
Maschio C57Bl6 / J topi con un peso medio di 25 g sono stati ottenuti da Harlan Winkelmann (Borchen, Germania). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la legge federale sulla protezione degli animali. I principi di cura degli animali da laboratorio sono stati seguiti. Gli animali sono stati mantenuti su un 12-ore ciclo luce / buio e dotato di roditori chow disponibili in commercio e l'acqua del rubinetto ad libitum. Animali dovrebbero essere accolti almeno 7 giorni dopo l'arrivo in stabulario prima degli esperimenti. Si noti che tutti gli esperimenti può essere facilmente adattato a ratti o ad altre specie e con lievi modifiche in modelli animali di grandi dimensioni.
2. Procedura Operativa
- L'anestesia è indotta e mantenuta con isoflurano (Abbott, Wiesbaden, Germania) in ossigeno. Dopo la comparsa di animali anestesia posto in posizione supina e le estremità fissare con nastro adesivo (Leukosilk, Beiersdorf, Amburgo, Germania). Dopo la disinfezione rasatura e chirurgica della parete addominale una laparotomia mediana viene eseguita su una lunghezza di 2 centimetri. Inserire nella cavità addominale attraverso un'incisione lungo la linea alba. Inserire due divaricatori sterili per mantenere l'addome aperto. Attenzione eventerate piccolo intestino a sinistra e posizionarlo su una garza di cotone bagnato.
- Evacuare l'intero contenuto del lume del piccolo intestino con due applicatori di cotone umido e sterile (mutilati, Neunkirchen, Germania) contemporaneamente rotolare l'applicatore dal piloro al cieco. ATTENZIONE: Evitare emorragie della parete dell'intestino tenue o lesioni dei vasi intestinali. Rimettere il budello nella caverna peritoneale senza torsione per prevenire l'ischemia o ostruzione meccanica e chiudere l'incisione addominale con un doppio strato continuo 5/0 in poliammide suture non riassorbibili (Ethicon, Norderstedt, Germania).
3. Cura postoperatoria
- Dopo la procedura di posizionare l'animale sotto una lampada di riscaldamento, observing finché non recuperato da anestesia. Mettere il mouse avanti nella sua gabbia e consentire l'accesso ad acqua e cibo. A causa della proprietà di oppioidi per influenzare la peristalsi, eseguiamo analgesia perioperatoria con FANS (per Metamizol esempio) in acqua potabile.
4. Funzionale studi 24 ore dopo IM
- Di transito gastrointestinale (GIT)
- Anestetizzare topi leggermente con isoflurano in ossigeno 22,5 ore dopo IM. Attenzione estendersi troppo la testa del mouse e tirare fuori la lingua con una pinza punte arrotondate. Riempire una siringa da 1 ml con almeno 100 pl marcato con fluoresceina destrano (FITC-destrano, 70.000 MW, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germania), collegarlo ad un catetere arterioso (Vygon, Ecouen, Francia) e con cautela inserire il catetere come un tubo gastrico nello stomaco.
- Brevemente iniettare 100 pl FITC-destrano ed estrarre il catetere. Lasciate che l'animale sveglio e attendere per 90 minuti. Durante questo periodo i topi hanno accesso a cibo o acqua. </ Li>
- Preparare quindici 2 tubi ml filatura e etichettarli consecutivamente.
- Eutanasia topi 90 minuti dopo gavage e rimuovere l'intero tratto gastrointestinale dallo stomaco al retto. Posizionare l'intestino su di un blocchetto di polistirolo ed evitare stiramento. CAVE: E 'fondamentale per rimuovere l'intestino delicatamente per evitare lo spostamento di liquido FITC-destrano nel segmento vicino. Per l'inizio potrebbe essere utile utilizzare clip all'inizio e alla fine di ogni segmento.
- Misurare lunghezza del piccolo intestino e la lunghezza del colon. Dividere il piccolo intestino in 10 segmenti uguali dimensioni da pinning verso il basso per il pad polistirolo con cannule. Dividere i due punti in 3 segmenti. Avete preparato 15 segmenti (stomaco # 1), dieci segmenti di uguali dimensioni del piccolo intestino (# 2-11), cieco (# 12) e tre 3 segmenti uguali dimensioni del colon (# 13-15).
- Transetto l'intestino nei punti contrassegnati, afferrare con una pinza e lavare una volta con 1,0 ml KHB nel preparato in precedenza KHB containing 2,0 ml provette e mescolare vigorosamente nel vortex per 20 sec. Lo stomaco ed il cieco sono posti direttamente e tagliate nelle provette preparate. Riempire questi tubi con 1,0 ml KHB, in tal modo il risciacquo tracce di contenuto luminale dalla forbice nei tubi.
- Centrifugare le sonde a 12,000 rcf per 5 min a temperatura ambiente in una centrifuga da tavolo. Durante la centrifugazione preparare altri 15 numerati progressivamente provette da 1,5 ml.
- Trasferire il surnatante chiaro nel nuovo tubo di 1,5 ml e conservare al buio a 4 ° C fino al momento dell'analisi (punto successivo). Le sonde possono essere conservati per diversi giorni a 4 ° C senza perdita significativa di segnale FITC. Per la conservazione prolungata aggiungere 0,09% Natrium-azide o conservare a <-18 ° C.
- Pipettare 100 ul duplets dei surnatanti su un nero piastra a 96 pozzetti (Greiner Bio One, Frickenhausen, Germania). Pipette due da 100 ml di campioni KHB come vuota.
- Leggere la piastra in un lettore di fluorescenza (Safire, Tecan, Crailsheim, Germania) e quantificare il fluorescence a 494 nm (assorbimento) / 521 nm (emissione) di lunghezza d'onda. Sottrarre i valori vuoti da campioni.
- Calcolare il centro geometrico (GC) di FITC-destrano distribuzione, che è in realtà il centro di gravità per la distribuzione di marcatore, con la seguente formula: GC = Σ (% del totale segnale fluorescente per segmento * numero di segmento) / 100
Nota: Moltiplicando percentuale di fluorescenza di ciascun segmento con il suo numero di segmento una media ponderata della distribuzione del marcatore all'interno dell'intestino viene valutata. Questo punto è influenzato sia la distribuzione e la distanza percorsa dal marker, ma non si assume alcuna specifica distribuzione sottostante. 7 Il valore calcolato GC viene spesso presentato in combinazione con un grafico che dimostra la distribuzione di destrano FITC sul tratto gastrointestinale (Figura 1A).
- Transito intestinale
- I topi devono essere debolmente anestetizzati con isoflurane 2% di ossigeno. ATTENZIONE: Assicurarsi che l'animale si risveglieranno entro 40 sec.
- Esaminare attentamente la pervietà del colon con l'inserimento di una sonda di fistola (asta di metallo, 2 mm di diametro) attraverso l'ano nel colon.
- Utilizzando la sonda fistola portare avanti un bicchiere due millimetri palla 3 cm nel colon ed estrarre la sonda immediatamente. Posizionare il mouse in una gabbia trasparente e iniziare a misurare il tempo dopo la sonda fistola è stato tirato fuori dal colon. Tenete d'occhio il mouse e fermare il tempo subito dopo la palla di vetro è diventato escreto.
5. Analisi istochimica di campioni isolati ME
- Segmenti Midjejunal sono tagliati dal intestino e immerso in KHB freddo in un piatto Sylgard-riempita.
- Mesentere è appuntato al piatto con 0,2 aghi insetti mm (Strumenti scientifici Arti, Heidelberg, Germania).
- Tagliare il segmento lungo il confine mesenterica e allungare a ~ 120% della sua lunghezza e larghezza. Finalizzare il fissaggio con insettopin sul sito opposto del mesentere. Sciacquare il piatto Sylgard accuratamente con KHB fresca ghiacciata, in tal modo tutte le vampate di calore contenuto luminale.
ME può meccanicamente separata dalla tunica mucosa a partire dal mesentere. Durante la preparazione sostituire fresche refrigerate volte KHB diverse. - Mucosa tunica separato può essere scossa congelati in azoto liquido per ulteriori analisi o scartato.
- Fissare il supporto isolato ME tutto con etanolo al 100% per 10 minuti a temperatura ambiente.
Lavare l'intero montaggio tre volte utilizzando KHB refrigerata. Nota: altri fissativi (cioè formaldeide 4%, acido acetico, acetone) può essere utilizzato anche dopo il test la sua compatibilità con la successiva analisi. - I supporti ME integrali sono pronti per un ulteriore colorazione istochimica o immunhistochemical:
- Istochimica: mieloperossidasi (MPO) colorazione
PMN infiltrato può essere esaminato dal seguente protocollo di colorazione MPO.- Risolvere i 10 mg Hanker reagente Yates (Polyscience Europa, Eppelheim, Germania) in 10 KHB ml e aggiungere 100 microlitri del 3% H 2 O 2. Preparare la soluzione di fresco immediatamente prima dell'uso e non riutilizzare.
- Incubare supporti interi per 10 min a temperatura ambiente.
- Sciacquare a lungo con i campioni KHB freddo e incubare per 10 min.
- Montare i campioni in mezzo di montaggio acquoso (Aquatek, Merck, Darmstadt, Germania) Dopo l'essiccazione per 2 ore analizzare i vetrini al microscopio luce.
- Contare il numero di cellule in 5 campi scelti a caso e calcolare come MPO cellule positive / mm 2.
- Colorazione immunoistochimica:
In accordo con la colorazione istochimica MPO, colorazioni immunoistochimiche dei monti interi può essere effettuata. Principalmente, i protocolli stabiliti colorazione immunoistochimica di colture cellulari o sezioni di tessuto può essere facilmente adattato ad una colorazione supporto intero. Tuttavia, la procedura di ottimizzazione per anti specificacorpi si consiglia vivamente.- Tagliare i campioni in 5 x 5 mm e pezzi effettuare la colorazione in 2.0 provette a fondo tondo centrifuga ml in ~ 150 ml - 200 microlitri soluzione di anticorpi.
- Fissaggio e bloccaggio procedura (cioè il 3% BSA in PBS per 1 ora a temperatura ambiente) può essere eseguita nel "piatto Sylgard".
- Fasi di lavaggio in PBS o altri buffer può essere eseguita in 12 pozzetti.
- Trasferire i campioni. Accuratamente con una pinza nette tra colorazione tubi e piastre di lavaggio.
- Dopo i provini finali montaggio procedura di lavaggio in anti-fading mezzo di montaggio con la polizza di copertura e analizzare con un microscopio a fluorescenza.
6. Cultura Organo di ME
- L'intero intestino piccolo viene resecato 24 ore dopo IM e posta in KHB freddo contenente 200 U / ml di penicillina G e 100 pg / ml di streptomicina (KHB + P / S).
- Tagliare l'intestino in 3 lunghezze cm e pin ogni segmento fino a un Sylgard contenente GLAss piatto.
- Rimuovere il mesentere con le forbici sottili e scivolare l'intestino su un ferro da calza.
- Delicatamente incidere la ME con una pinza taglienti e striscia fuori dalla sottomucosa con un applicatore umido cotone. La mucosa tunica rimane sul ferro da calza e può essere congelato a scatto per ulteriori indagini. Il ME è raccolto in freddo KHB + P / S.
- Tagliare le strisce isolate ME in piccoli pezzi di 2-4 mm di lunghezza e incubare in ghiaccio freddo KHB + P / S per una mezz'ora e sciacquare il campione più volte.
- Trasferire circa 50-60 mg ME (almeno metà ME di uno piccolo intestino) in una sterile 24 pozzetti contenente 500 microlitri s Dulbecco modified Eagle medium (DMEM).
- Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per ulteriori 24 ore.
- Ispezionare le colture cellulari per la contaminazione batterica o fungina sotto un microscopio.
- Raccogliere il surnatante, centrifugare per 5 minuti a 1000 rcf e congelare in azoto liquido a scatto. Nel frattempo asciugare asciugare il muscLe tessuto su un tessuto pulito per 30 sec e peso.
- Supernatanti possono essere utilizzati per la successiva analisi di citochine rilasciate (IL-6) mediante ELISA o altri metaboliti (cioè nitrito) nel surnatante produce seguendo le istruzioni.
- Normalizza le concentrazioni misurate per peso di ME tessuto.
7. Risultati rappresentativi
- Studi funzionali
Il parametro più importante per valutare la gravità POI è l'esame di GIT in vivo. Figura 1A mostra una tipica distribuzione di destrano FITC lungo il tratto gastrointestinale in controlli non trattati e manipolati intestinally topi 24 ore dopo l'intervento chirurgico. "Sham gestito" animali hanno mostrato una GIT normale con un centro di calcolo geometrico (GC) nel cieco mentre IM portato ad un significativo ritardo di GIT nel digiuno prossimale (Figura 1B)
Motilità del colon è stata focalizzata sulla separatamente dalla misura del tempo di escrezione o pallaFA 2 millimetri di vetro palla. Sham operati topi mostrano un tempo di escrezione di 48 - 200 sec mentre IM portato ad un tempo di escrezione prolungata tra 470-775 sec (Figura 1C). - Studi morfologici
Per descrivere il infiammatoria estendere entro i fenotipi ME vari leucociti potrebbero essere analizzati con istochimica e immunoistochimica. Nella figura 2A + B una bassa presenza di PMN in "sham operato" animali è stato osservato (39 ± 7 cellule / mm 2). IM del piccolo intestino ha portato ad una forte infiltrazione PMN (660 ± 86 cellule / mm 2) rispetto ai topi finti azionati - ME Organ Culture
Molti mediatori infiammatori liberati dalle cellule sono difficili da rilevare in lisati di tessuto. Culture Organo consentono di individuare dei mediatori liberati nel supernatante di coltura. Un mediatore rappresentante in PDI è NO, che è importante neurotrasmettitore inibitorio nel tratto gastrointestinale. 5
NO non è stato possibile rilevare in ME cul organosurnatanti tura di animali di controllo non operati (5 ± 6 mM / 24 ore / mg di tessuto). In finti azionati (laparotomia) topi basali livelli di NO di 53 ± 36 micron / 24 ore / mg di tessuto sono stati osservati. ME colture di topi intestinally manipolati (raccolte 24 ore dopo l'intervento chirurgico) producono molto più NO (2254 ± 853 pM / 24 ore / mg di tessuto) durante le 24 ore organo cultura ME (Figura 3).
Figura 1. Effetto di IM sul GIT (A + B) e di transito del colon (C) GIT è stata misurata come percentuale di non assorbibile marcato con fluoresceina destrano in 15 segmenti gastrointestinale-stomaco (Sto), intestino tenue (SI 1-9 ), cieco (Cec), e del colon (Co) -90 minuti dopo l'ingestione orale. Transito del colon è stata misurata come il tempo di tirare fuori la sonda fistola fino escrezione di un mm 2 perle di vetro. (A) distribuzione gastrointestinale di fluoresceina isotiocianato-dextran dopo la finta operazione o IM. Negli animali sham operati più del marcatore si trova nel cieco o colon prossimale rispetto prossimale in posizione digiunale animali manipolati. Le linee tratteggiate indicano calcolato GC. (B) Calcolo del GC ha dimostrato un tempo prolungato di transito gastrointestinale dopo IM. (C) il tempo di transito del colon hanno mostrato un ritardo significativo nei topi IM rispetto con gli animali finti operati. GC per i 15 segmenti intestinali sono visualizzati come media (n = 5). I tempi di transito del colon sono stati visualizzati dire con tutti i valori individuali (n = 6). *** = P <0,001, di Student t-test.
Figura 2. Rilevamento di MPO cellule positive all'interno del piccolo intestino ME. (A) ME supporti intere sono state colorate con il reagente Hanker Yates per il rilevamento di MPO positivi PMN 24 ore dopo laparotomia (falsa) o procedura di IM. (B) Quantificazione dei MPO cellulare positiva entro 5 campi scelti a caso per topo. n = 6 animals per gruppo. *** = P <0,001, di Student t-test.
Figura 3. Produzione di NO in surnatanti di colture di ME. Campioni muscolari da controlli non operati, sham gestito e topi IM sono stati presi 24 ore dopo l'intervento e coltivate per 24 ore. Topi non trattati hanno mostrato solo una bassissima produzione basale di NO. Dopo laparotomia NO liberazione è aumentata senza misurare differenze significative tra il gruppo di controllo e topi sham operati. 24 ore dopo la produzione di NO IM è notevolmente aumentata rispetto ai topi non trattati a comando o sham. n = 5 animali per gruppo. *** = P <0,001, 1 ANOVA modo.
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Discussion
Uno studio comparativo analizzando i diversi livelli di IM (eventratio piccolo intestino per 10 minuti contro delicatamente l'ispezione del piccolo intestino con due applicatori di cotone contro IM con l'evacuazione del contenuto dell'intestino tenue nel cieco) ha evidenziato una correlazione tra il grado di manipolazione chirurgica e POI. Rispetto agli altri gruppi IM mostrato la più alta quantità di leucociti nel ME (PNMs, macrofagi e mastociti) conseguente POI prolungata e grave. 8.
Nello stabilire il modello di IM, funzionamento standardizzato e la forza di manipolazione dell'intestino sono passaggi critici. Toccando il mesentere durante questa procedura deve essere rigorosamente evitato per prevenire emorragie. Resistenza insufficiente durante IM provocherà una mancanza di distensione del piccolo intestino. IM tecnica e la forza varia tra chirurghi diversi può portare ad una variazione significativa di accadimento POI. Lo stesso operatore deve manipolare tutti gli animali in un esperimento.
GIT Analisi e transito intestinale in vivo è fondamentale e deve essere eseguita con attenzione. Ogni animale deve essere alloggiati durante la procedura in gabbie buie e in una stanza silenziosa. Animali dovrebbero essere accolti almeno 7 giorni dopo l'arrivo nella struttura animale adepto per l'ambiente (cibo, acqua, sale, luce cicli di buio, le condizioni immunologiche). Misurazione sia, GIT e transito intestinale, permette anche di distinguere tra infiammazione intestinale e paralisi in aree trattate e non trattate. 9 Un altro metodo sofisticato di registrazioni in motilità vivo nei roditori è stato descritto da svegli Königsrainer et al. 10 estensimetro usando trasduttori posto sullo stomaco, digiuno e del colon. Il grande vantaggio di questo metodo è che i disturbi della motilità può essere esaminato indipendentemente e continuamente in diverse parti del tratto gastrointestinale nello stesso animale in giorni consecutivi. Tuttavia la produzione di strain trasduttori e l'operazione necessaria per impiantare loro sono elaborate rispetto al GIT.
In POI, la diffusione della paralisi intestinale è noto come effetto di campo gastrointestinale. 11 Un precedente lavoro del nostro gruppo dimostra con l'uso dei metodi attuali che immunociti da intestinally manipolato piccolo intestino diffondere al colon non manipolata 12.
La procedura chirurgica non deve tradursi in una morte o complicanza maggiore (come emorragia o peritonite). Misurazione di infiltrati GIT e PMN in ME monti interi dimostra che IM è un modello altamente riproducibile e fattibile per indurre POI nei roditori.
Fissazione e colorazione mieloperossidasi deve essere eseguita immediatamente dopo l'espianto di organi. Lunga conservazione dei campioni a risultati acquose tampone a eluizione di mieloperossidasi dal tessuto.
Misurazione di ossido nitrico è un esempio di meComunicato diator da colture d'organo: Come mostrato prima della manipolazione intestinale ha comportato un sovraregolazione di iNOS in macrofagi del ME che porta a una liberazione eccessiva di disturbi della motilità intestinale NO e 5 Con la misurazione della concentrazione di NO nel supernatante di coltura ME una dichiarazione circa l'. misura infiammatoria o l'efficacia terapeutica è possibile. Molte altre molecole (IL-6, TNF-alfa, ecc) può essere facilmente esaminato nei surnatanti di tessuto coltivato dalla classica ELISA o approcci multiplex come immunoenzimatico Multiplex Luminex 13 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
In sintesi, IM è un affidabile e di valore che inducono l'infiammazione intestinale modello e disturbi della motilità successive. La semplice separazione meccanica di ME e mucosa tunica permette ai ricercatori di distinguere l'effetto in entrambi i compartimenti intestinali parete, che è di grande interesse in quanto il intestinale ME ha dimostrato di essere un tessuto altamente attiva immunologica. L'analisi in vivo di GIT e transito intestinale è stato sviluppato come gold standard nel rilevamento e la quantificazione dei disturbi della motilità intestinale.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft (KA1270/3-1/2) e BONFOR (O-112,0040).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethilon 5/0 | Ethicon | 1666H | |
| Cotton applicators | MaiMed | 71010 | |
| arterial catheter | Vygon | 115-798 | |
| 96 well plate (black) | Greiner Bio One | 655096 | |
| glass ball (2 mm diameter) | Worf | available on request | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Hanker Yates Reagent | Polyscience | 560694 | |
| Aquatek | Merck | HC109850 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604 F | |
| FITC-dextran (MW 70000) | Sigma Aldrich | 46945-500MG-F |
References
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