Summary
我们描述一个综合性的方法，精确，立体的人多形性胶质母细胞瘤细胞植入到裸鼠的大脑和随后的串行
Abstract
胶质母细胞瘤（GBM）是一种高品位的原发性脑肿瘤在人类中位生存期仅为14.6个月，尽管标准的三模态的治疗包括手术切除，手术后的放射治疗和替莫唑胺化疗1。显然需要新的治疗方法，以提高患者生存率和生活质量。 GBM的动物模型的，概括人类疾病还允许串行成像技术监测肿瘤的生长和治疗反应，将有助于发展更有效的治疗策略。在本文中，我们描述了我们的技术，精确的立体定向植入生物成像GBM肿瘤细胞的裸鼠移植瘤，概括主要临床特征的GBM 2的大脑。这种方法产生的肿瘤是可重复和精确的解剖位置，同时允许在体内生物发光成像的连续监测内颅移植瘤的生长和治疗3-5。这种方法也很好的耐受性低的围手术期发病率和死亡率的动物。
Protocol
A.术前肿瘤细胞制备
- 混合厚膜U251多形性胶质母细胞瘤细胞稳定表达萤火虫荧光素酶基因的慢病毒表达载体（pGreenFire，系统生物科学）。
- 这些细胞被生长在10ml完整的Dulbecco的修改的Eagle培养基（DMEM）中，其中包括的DMEM补充10％小牛血清，1％青霉素 - 链霉素，1％非必需氨基酸在一个的T75组织培养烧瓶中孵育5％CO 2和37℃下
- 执行标准细胞培养开始，用洗涤的细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS），其次是胰酶消化。
- 淬灭与完全DMEM的胰蛋白酶，将溶液转移到一个50毫升的锥形烧瓶中，并用Coulter计数器确定细胞浓度。
- 在约3000转每分钟的3分钟，离心收集的细胞在完全DMEM。
- 离心后，吸f的媒体，只留下一个在底部的50毫升锥形瓶中的细胞沉淀。
- 工作迅速，以防止干燥的细胞，重新悬浮细胞在一定体积的新鲜完全DMEM以达到所需浓度的50,000个细胞/μl，并转移至2毫升无菌小瓶置于冰上。
- 在低设置〜20分钟，以防止细胞粘附，细胞在冰上进行简单的振荡。细胞可以安全地用于颅内植入了两个小时后，放置在冰上。
B.原位异种移植植入
- 称取裸体裸鼠：NCR鼠标（女/女），建立一个基线，胚胎植入前的重量。我们通常选择6-10周龄小鼠17克和24克的重量之间。
- 1小时，在植入前，预先用5毫克/公斤的非甾体类抗炎药美洛昔康经皮下注射作为手术后的疼痛和炎症的治疗药物鼠标。
- Anesthetize的动物腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪的混合物中，在140毫克/千克和10毫克/公斤分别的剂量。
- 确认鼠标评估动物的自发的回应掐脚趾有足够的麻醉。如果动物的脚趾掐响应，延迟的过程，，直到麻醉才能生效，或考虑注入额外的麻醉（原量的25％）。
- 准备的麻醉鼠标进行定位的Stoelting数字只是鼠标立体平台（Stoelting公司）挂钩鼠标的门牙牙齿的咬酒吧的吻部限制器和紧缩的鼻钳过的吻，同时确保，鼠标的头部是上一个水平的飞机。
- 转移内敛鼠标Stoelting立体定向平台，调整耳杆的前端，使该动物的定位在耳道的尾端。一旦动物的颅到尾部的定位已经adjus，TED，确保咬棒的立体框架。鼠标应该搁在一个公司塑料加热板（哈佛大学设备），用胶带固定Stoelting平台，提供反馈控制温度调节在手术过程中。
- 调整必要时耳杆的高度，然后推进到耳道的尾部的耳杆，把它们固定，使得鼠标的头部是在一个水平面上，并固定在手指触摸。仔细监督的耳棒放置后的呼吸窘迫的迹象。松开并重新定位，如果动物是在遇险。
- 插入的润滑尖的一个直肠温度探头连接到的TCAT-2DF温度控制器（哈佛大学设备），以监控动物的温度，并以提供反馈控制的加热板定位下鼠标，以保持动物的体温在36°Ç在的程序。
- 眼药膏对眼睛preveNT干燥。
- 应用聚维酮碘溶液的顶部，鼠标的头部切口部位进行消毒，照顾，以避免眼睛。
- 执行一个脚趾头掐确认鼠标是无意识的，提供额外的氯胺酮/甲苯噻嗪的初始剂量（<25％），如果需要少量的。
- 清洁的0.45毫米毛刺钻头（Stoelting）连接到使用酒精垫的的钻头（Foredom微钻头），然后消毒钻头，持续15秒，在一个玻璃珠灭菌器（种子发芽500，CellPoint科学），只有在钻头进入浸入珠灭菌器。
- 使用无菌解剖刀，使一个0.75厘米的切口在中间头皮从尾端的眼睛的水平延伸的纵向。确认前囟的可视化。
- 附加的钻头架的Stoelting平台放置一个的钻头（Foredom微钻头）与0.45毫米毛刺钻头（Stoelting）在钻头架，它固定在适当位置。
- 将钻头完全在T他囟，然后零出的x，y，z坐标的数字立体显示。的钻头的前端移动到一个位置后2毫米和1.5 mm横向囟在右大脑半球和动物的颅骨与Foredom钻头钻入，刺入只有骨。可使用的无菌棉签轻轻缩回的切口的边缘，以方便的头骨的可视化。
- 取出钻头和钻架的立体平台。
- 将Nanomite注射器注射泵（哈佛大学设备）的立体平台。
- 从冰中取出的细胞，或者轻轻涡小瓶含有肿瘤细胞短暂脉冲或轻轻一抖小瓶重新悬浮细胞。 7微升的细胞悬液通过30号“长平锥针连接到10μl注射器（Hamilton注射器）。避免大气泡的注射器，确保在最初的6μl的液体有没有气泡WH脑出血将鼠标注入的总体积。在其它的1微升的小气泡是不关心。避免重复拉伸起坐如果可能的话，以尽量减少损坏细胞的细胞悬浮液。
- 定位到注射器喷射器加载的注射器。使用的醇垫，除去任何的细胞悬浮液的流体出现在针尖与癌症细胞，这可能会导致肿瘤生长在颅外空间的切口处，以防止污染。
- 设置该喷射泵提供6.0微升0.5微升/分钟的速率。确保经常收集在注射器中的空气气泡没有注入到动物中，残留在注射器中，在植入后的细胞悬浮液的1微升。注入气泡，可能会导致致命的空气栓塞。
- 推进注射器针头插入保持针垂直（90度）到所述颅骨钻孔。一旦针已经走过的头骨，零出coordin阿泰上的立体定向的数字显示和然后慢慢推进针尖的超过4分钟的一段时间，直到它到达一个深度为2.5毫米。针穿过后海马皮层和部分。的x，y，z坐标用于立体定向植入的选择生成的大脑半球内的横向定位的肿瘤，同时避免损伤关键大脑结构如丘脑和接近的心室，从而减少的可能性播种与肿瘤细胞的脑脊液可能会引起不良的椎管内肿瘤。选择一个相对于前囟门后的位置，以减少的可能性大，局部晚期肿瘤，溃疡进入轨道。暂停针深度2分钟，然后启动的细胞的植入。
- 在植入过程中，干燥的头骨，多次与一个显微外科海绵矛，删除任何肿瘤的液体，可能已经回流的钻孔植入。避免扰乱针显微海绵。删除此液减少的在颅外空间肿瘤生长的可能性。
- 注射完成后，在大脑中留下针约2分钟，然后慢慢地撤回针超过3-4分钟期间。
- 松开耳朵酒吧和吻部限制器和删除鼠标从立体定向设备。
- 关闭在颅骨钻孔，用无菌骨蜡沉积钻孔的无菌棉签的木端之间来回擦蜡。继续施加骨蜡，直到被完全密封孔和骨蜡密封钻孔是与相邻的头骨平齐。
- 重新接近边缘的切口，用无菌棉签和应用兽医组织胶封住伤口，照顾动物的眼睛，以避免胶水曝光。
- 最后，将鼠标放在一个加热垫设置为37°。动物C，直到恢复意识。的动物转移到原来的笼子，一旦鼠标警报和反应。
C.生物发光成像（BLI）来监测肿瘤生长及对治疗的反应
简要说明遵循的生物发光成像。
- 麻醉小鼠，在一个腔室中，用2％异氟烷和氧先前与肿瘤植入。
- 虽然小鼠麻醉，皮下或腹腔内注入它们的D-荧光素的钾盐在PBS中稀释至浓度为50毫克/毫升，用60微升。
- 打开的流量麻醉中的生物发光成像扫描仪的鼻锥，并迅速转移的小鼠的扫描仪放置鼻的鼻锥。
- 放置黑色的老鼠之间的分隔限制到相邻的肿瘤出血肿瘤生物发光信号的信号强度高与低得多的信号。
- 运用活体成像软件，频繁序列性风险的D-荧光素注射后的总持续时间长达30分钟。我们看好的曝光时间设置为“自动”限制的可能性下或过度曝光的图像。没有一个单一的曝光应该是5分钟。
- 在适当的时间间隔执行重复生物发光成像。串行每周成像是一个合理的选择许多纵向的实验测试对治疗的反应。
- 收购后的图像，使用活体成像软件程序来分析肿瘤的生物发光成像会议期间获得的每幅图像中绘制每个肿瘤周围地区的利益（投资回报率）。第二个较小的感兴趣区域的应用到各小鼠的下侧面在每个图像中感兴趣的纠正肿瘤的生物发光信号的基于背景的生物发光信号强度的程度上为背景区域。我们更喜欢使用“Radiance”号设置，而不是“计数”作为输出生物发光信号的值。
- 结果到Excel中导出的投资回报率，并确定每个鼠标的最大背景调整后的生物发光信号。
- 重复生物发光成像，作为连续监测肿瘤的生长。在我们的实验中，我们执行每周BLI。我们更喜欢确定，BLI的最大信号，对于一个给定的成像会话以频繁曝光超过5 - 30分钟后，注射D-荧光素。
D.代表性的成果
这种立体定向的植入技术相关联的一个成功的肿瘤率90-100％，并与围手术期死亡率低，通常小于5％。意想不到的副作用的风险也低，使用这种技术，包括作为播种的脊髓从注入脑室，或颅外肿瘤生长的肿瘤细胞，无论从播种的切口与肿瘤细胞或毛刺孔封闭不足等并发症一llowing颅内肿瘤扩大开幕的头骨。
移植瘤的体外分析表明预期缺氧，血管内皮生长因子的表达增加，坏死。稳定表达由我们的GBM细胞线的绿色荧光蛋白（GFP）的荧光显微镜揭示浸润这些异种移植物的性质。
图1示出了一个典型的成功GBM细胞鼠标进入脑立体定向植入的结果。这是一个T2加权脑部核磁共振成像扫描的一个9.4特斯拉磁体植入后21日内这里描述的技术进行小鼠脑。 图1显示右侧大脑半球肿瘤中（轮廓的粉红色）测量单次对焦19毫米3定位于的植入位点的精确坐标。
图2示出了生物发光成像的结果，使用技术部 iques这里描述为一组10只小鼠用均匀分层最大的生物发光信号强度的基础上，接受全脑照射（4戈瑞×4每天分数）或没有治疗的立体定向移植瘤。在该实验中，生物发光成像示出了放射治疗抑制移植瘤的增殖，产生在所检测到的生物发光信号中没有增加，而信号基本上增加模拟照射控制肿瘤，由于未选中的癌细胞增殖。
图1（视频）。冠状MRI节的小鼠脑含U251多形性胶质母细胞瘤的肿瘤体积与等高线（粉红色）。在9.4特斯拉的扫描仪进行扫描，使用一个自旋回波T2加权协议。 点击这里观看电影 。
再2“SRC =”/ files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg“/>
图2。立体定位植入的多形性胶质母细胞瘤治疗的10只小鼠，无论是外照射放射治疗16 Gy的4份或不治疗。对小鼠进行成像的生物发光成像治疗前和治疗开始后，每周。该图给出相对倍的变化电流最大BLI值到治疗前的最大BLI值的比率被定义为作为倍的变化中位数计算的生物发光。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在本文中所描述的小鼠肿瘤细胞立体定向植入的方法，可重复生成肿瘤的浸润和快速增长的模式，临床多形性胶质母细胞瘤2，6-8，合理地概括。此技术特别适合均匀地不同的可比尺寸和生物学性质，并在特定的解剖位置的重现性肿瘤的治疗组中是可取的分层小鼠的实验。立体定向植入肿瘤细胞的技术，我们描述应该是容易实现的，大多数的翻译研究实验室7,9-11。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们非常感谢安德鲁·霍兰德博士，萨拉·戴维斯，李舒曼，蒂姆·詹金斯博士祥盛徐的专家协助。我们承认安·肯尼迪博士的支持。 BCB支持的放射生物学培训津贴C5T32CA009677的。 JFD宝来惠康成就奖，医学科学家（1006792）的支持。 JLB支持的超类（5 R25 CA140116-03）资助。我们要感谢史蒂夫哈恩博士的鼓励和支持，使我们的研究可能。我们还要感谢大学的宾夕法尼亚州纳米生物界面中心（NBIC）博士和丹尼斯迪彻的的鼓励和有益的意见。我们认识到，小动物成像设备（SAIF）在美国宾夕法尼亚大学的MRI和光/生物发光核心设施的使用。这些技术开发项目的一部分，由美国国立卫生研究院（RC1 CA145075和K08 NS076548支持01）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic platform for mouse implantation |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| Puralube Vet Ointment (ophthalmic) | Amazon.com | To prevent drying of the mouse's eyes | |
| drill holder for the stereotactic platform | Stoelting | 51681 | |
| Micromotor Electric Drill | Stoelting | 51449 | For drilling through the skull |
| .45 mm carbide drill bit | Stoelting | 514551 | |
| Sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Glass bead dry sterilizer (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER-5287 | To sterilize metal surgical instruments |
| Mouse rectal probe | Braintree Scientific | RET-3-ISO | Compatible with the temperature controller |
| Temperature Controller (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Temperature controller to maintain animal's temperature during surgery |
| Small heating plate | Harvard Apparatus | 727617 | For use with temperature controller to warm mouse during surgery. The heating plate fits under the mouse on the stereotaxic platform. |
| Disposable Scalpels | BD Bard-Parker | 2015-11 | #10 scalpel |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | For injection of tumor cells |
| 30 gauge needles, 1" long, with flat point | Hamilton | Various | Must be compatible with the 10 μl syringe |
| Nanomite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704507 | Digital motorized syringe injector for stereotaxic device |
| Cellulose sterile surgical spear sponges | Ultracell | 40410 | To dry the surgical field |
| Bone wax | Ethicon | W31 | To seal the burr hole |
| Tissumend II synthetic absorbable tissue adhesive | Veterinary Products Laboratories | 3002931 | To seal the incision |
| Hot water pump with warming pad | Gaymar | TP-650 | Warms mice in post-operative period |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | Luciferin for bioluminescent imaging |
References
- Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro. 3, e00063 (2011).
- Shelton, L. M. A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion. J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).
- Brehar, F. M. The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain. J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Radaelli, E. Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease. Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).
- Baumann, B. C. Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy. , Submitted (2012).
- Baumann, B. C. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). Transl. Oncol. , Forthcoming (2012).
- Park, S. S. MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).
- Szentirmai, O. Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect. Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).
- Dinca, E. B. Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy. J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).
