Summary
Vi beskriver en integrerad metod för exakt, stereotaktisk implantation av humana glioblastoma multiforme in i hjärnan hos nakna möss och efterföljande seriella
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) är en högvärdig primär hjärncancer med en medianöverlevnad på endast 14,6 månader hos människor, trots standard tri-modalitet behandling bestående av kirurgisk resektion, postoperativ strålbehandling och temozolomid kemoterapi 1. Nya terapeutiska metoder är tydligt för att förbättra patientens överlevnad och livskvalitet. Utvecklingen av effektivare behandlingsstrategier skulle underlättas av djurmodeller av GBM som rekapitulera mänsklig sjukdom ändå tillåta seriell avbildning för att övervaka tumörtillväxt och behandlingssvar. I detta dokument beskriver vi vår teknik för exakt stereotaktisk implantation av biologiskt utskrivbara celler GBM cancer i hjärnan på nakna möss resulterar i tumörxenografter som rekapitulera viktiga kliniska tecken på GBM 2. Denna metod ger tumörer som är reproducerbara och är belägna i exakt anatomiska ställen samtidigt in vivo bioluminescent avbildning till seriellt övervaka handelnkraniell xenotransplantat tillväxt och respons på behandling 3-5. Denna metod är också väl tolereras av djuren med låg perioperativ morbiditet och mortalitet.
Protocol
A. preoperativ tumörcell Förberedelser
- Transduktion U251 glioblastoma multiforme celler med en lentiviral expressionsvektor (pGreenFire, System Biosciences) att stabilt uttrycka eldflugeluciferasgenen.
- Dessa celler odlades i 10 ml komplett Dulbeccos modifiering av Eagles medium (DMEM), som består av DMEM kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 1% penicillin-streptomycin och 1% icke-essentiella aminosyror i en T75 vävnadsodlingskolv inkubering vid 5% C0 2 och 37 ° C.
- Utför standard cellodling, börjar med tvättning av cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av trypsinizing.
- Släck trypsin med fullständigt DMEM, överför lösningen till en 50 ml E-kolv och bestämma den cellulära koncentrationen med Coulter Counter.
- Centrifugera de skördade cellerna i komplett DMEM under 3 min vid ungefär 3.000 varv per minut.
- Efter centrifugering, aspirera påf mediet lämnar endast en pellet av celler vid botten av 50 ml konisk kolv.
- Arbeta snabbt för att förhindra att cellerna från att torka ut, återsuspendera cellerna i en volym av färsk fullständigt DMEM för att uppnå den önskade koncentrationen av 50.000 celler / mikroliter och överför till en 2 ml steril flaska placerades på is.
- Celler på is bör kort vortexades på en låg inställning var ~ 20 min för att förhindra cellvidhäftning. Celler kan användas säkert för intrakraniella implantationer upp till två timmar efter placering på is.
B. ortotop xenograft Implantation
- Väg naken atymiska NCR mus (nu / nu) för att etablera en baslinje, före implantation vikt. Vi väljer oftast möss 6-10 veckors ålder med vikter mellan 17 och 24 gram.
- 1 timme före implantation, före medicinera musen med 5 mg / kg av den icke-steroida anti-inflammatoriska läkemedel meloxikam via subkutan injektion som en behandling för postoperativ smärta och inflammation.
- Anesthetize djuret med en intraperitoneal injektion av en ketamin / xylazin blandning vid en dos av 140 mg / kg och 10 mg / kg.
- Kontrollera att musen är tillräckligt sövd genom att bedöma djurets spontana svar på en tå nypa. Om djuret svarar på tå nypa, fördröja proceduren tills bedövningen kan träda i kraft eller överväga att injicera ytterligare anestesi (<25% av det ursprungliga beloppet).
- Förbered sövd musen för positionering i Stoelting Digital Bara för mus Stereotaktisk plattform (Stoelting Inc.) genom att haka musens framtänder i bettet bar nosen förband och dra åt näsan klämman över nosen samtidigt som musens huvud är på en nivå plan.
- Överför återhållsamma musen på Stoelting stereotaktisk plattformen, justera placeringen av djuret så att spetsarna på örat staplarna är i den kaudala änden av hörselgången. När djurets kraniala till stjärtfenan positionering har inställTed, säkra bettet bar till den stereotaktiska ramen. Musen ska vila på en fast plast värmeplatta (Harvard Apparatus) fästs med tejp på Stoelting plattformen att ge feedback-kontrollerad temperatur reglering under operationen.
- Justera höjden på örat barer behov och sedan avancera örat barer i den kaudala delen av hörselgången, säkra dem så att musens huvud är i en nivå plan och immobiliseras på finger touch. Noggrant övervaka för tecken på andnöd efter placering i örat barer. Lossa och åter ställning om djuret är i nöd.
- Sätt smorda spetsen på en rektal temperatursond ansluten till TCAT-2DF temperaturregulator (Harvard Apparatus) att övervaka djurets temperatur och att tillhandahålla återkopplingsstyrning för att värmeplattan placerad under musen för att bibehålla djurets kroppstemperatur vid 36 ° C under förfarandet.
- Applicera oftalmisk salva till ögonen för att Prevent torkning.
- Applicera betadinlösning till toppen av musens huvud för att desinficera snittet webbplats noga med att undvika ögonen.
- Gör en tå nypa för att bekräfta musen är medvetslös, leverera en liten mängd extra ketamin / xylazin (<25% av den initiala dosen) om det behövs.
- Rengör 0,45 mm Burr borr (Stoelting) fäst borren (Foredom Microdrill) användning av en alkohol dyna och sedan sterilisera borrkronan i en glaspärla steriliseringsanordning (Germinator 500, CellPoint Scientific) under 15 sekunder, nedsänkning endast borrskäret i Autoklaven pärlorna.
- Med en steril skalpell görs en 0,75 cm snitt längsgående i mitten hårbotten sträcker sig från ögonhöjd kaudalt. Bekräfta visualisering av bregma.
- Fäst borren innehavare till Stoelting plattformen och placera en borr (Foredom Microdrill) med en 0,45 mm Burr borr (Stoelting) i borren hållaren, säkra den på plats.
- Placera borrkronan exakt över than bregma och sedan noll-out x, y, z-koordinaterna för den digitala stereotaktiska displayen. Flytta borrspetsen till en position 2 mm posteriort och 1,5 mm lateralt om bregma i den högra cerebrala hemisfären och borra i djurets skalle med Foredom borr, piercing endast benet. En steril bomullstopp kan användas för att försiktigt dra kanterna av snittet för att underlätta visualisering av skallen.
- Avlägsna borren och borren hållaren från stereotaktiska plattformen.
- Fäst Nanomite injektor sprutpump (Harvard Apparatus) till stereotaktisk plattformen.
- Ta bort celler från is och antingen försiktigt vortexa flaskan med tumörcellerna med korta pulser eller knacka försiktigt på flaskan för att återsuspendera cellerna. Upprätta 7 pl av cellsuspensionen genom en 30 gauge 1 "lång platt avfasning nål fäst vid en 10 ^ spruta (Hamilton spruta). Undvik stora luftbubblor i sprutan. Se till att det inte finns några luftbubblor i den inledande 6 il vätska which blir den totala volymen injicerades i musen. Små luftbubblor i resterande 1 pl ingår inte. Undvik upprepade draw-ups av cellsuspensionen om möjligt för att minimera skada på cellerna.
- Placera den laddade sprutan i injektorn. Använda en spritsudd, ta bort av cellsuspensionen vätska som visas på spetsen av nålen för att förhindra kontaminering av snittet webbplats med cancerceller som kan leda till tumörer växer i extrakraniell utrymmet.
- Ställ injektor pumpen att leverera 6,0 | il med en hastighet av 0,5 | il / min. Den 1 il cellsuspension kvar i sprutan efter implantering säkerställer att luftbubblor som ofta samlas i sprutan inte injiceras i djuret. Injektion av luftbubblor kan orsaka en dödlig luftemboli.
- För fram injektionsnålen i borrhålet hålla nålen vinkelrätt (90 grader) till skallen. När nålen har förts skallen, noll ut coordinAtes på stereotaktisk digital display och sedan långsamt föra spetsen av nålen över en period av 4 min tills den når ett djup av 2,5 mm. Nålen passerar genom cortex och delar av den bakre hippocampus. X, y-, z-koordinater för stereotaktisk implantation valdes för att alstra ett lateralt positionerat tumören inom den cerebrala hemisfären samtidigt undvika skada på kritiska hjärnstrukturer såsom thalamus och närhet till ventriklarna, vilket minskar sannolikheten för ympning av cerebrospinalvätska med tumörceller som kan ge upphov till oönskade spinal tumörer. En bakre läge i förhållande till bregma valdes för att reducera sannolikheten för en stor, lokalt avancerad tumör ulcerating i omloppsbana. Paus med nålen på djupet under 2 min och sedan initiera implantation av celler.
- Under implantation torka skallen upprepade gånger med en mikrokirurgisk svamp spjut för att avlägsna tumören som innehåller vätska som kan ha återflöde från borrhålet underimplantering. Inte störa nålen med mikrokirurgisk svamp. Att avlägsna denna vätska bör minska sannolikheten för tumören växer i extrakraniell utrymmet.
- Efter injektion är klar, lämna nålen i hjärnan under ca 2 minuter och sedan långsamt ut nålen under en period av 3-4 minuter.
- Lossa örat barer och nos förband och ta bort musen från den stereotaktiska apparaten.
- Stäng borrhålet i skallen med steril benvax deponeras genom att gnida vax fram och tillbaka över borrhålet från trä änden av en steril bomullspinne. Fortsätta att tillämpa benvax tills hålet är helt förseglad och benvax tätar borrhålet är i jämnhöjd med den intilliggande skallen.
- Re-ungefärliga kanter snittet med sterila bomullspinnar och tillämpa veterinär vävnadslim att täta såret, var noga med att undvika lim exponering djurets ögon.
- Slutligen, placera musen på en värmedyna inställd på 37 °C tills djuret återhämtar medvetandet. Överför djuret tillbaka till sin ursprungliga bur när musen är alert och lyhörd.
C. Bioluminescent Imaging (BLI) för att övervaka tumörtillväxt och terapisvar
Korta instruktioner följer för självlysande avbildning.
- Söva möss som tidigare implanterats med tumör i en kammare med 2% isofluran och syre.
- Medan mössen sövs, injicera dem antingen subkutant eller intraperitonealt med 60 | il av D-luciferin kaliumsalt utspädd i PBS till en koncentration av 50 mg / ml.
- Slå på strömmen av anestesi till noskoner i självlysande bildbehandling skannern och snabbt överföra mössen till skannern placera sina trynen i näsan kottar.
- Placera svarta avdelare mellan möss för att begränsa blödning av självlysande signal från en tumör med hög signal intensitet till en intilliggande tumör med mycket lägre signal.
- AnvändaLiving bildbehandlingsprogram, ta täta seriella exponeringar under totalt upp till 30 minuter efter tidpunkten för injektion av D-luciferin. Vi är för att ställa exponeringstiden på "Auto" för att begränsa risken för en under-eller överexponerade bilder. Ingen enskild exponering ska vara> 5 minuter.
- Utför upprepa bioluminescent avbildning med lämpliga intervall. Serial vecka avbildning är ett rimligt alternativ för många längsgående experiment testa svar på behandlingen.
- Efter förvärvet av bilder, använd Living programmet Image programvara för att analysera tumörer genom att rita en region av intresse (ROI) runt varje tumör i varje bild förvärvats under självlysande bildbehandling session. Applicera ett andra, mindre region av intresse till den nedre flanken av varje mus i varje bild som en bakgrund region av intresse för att korrigera det bioluminescenta signalen av tumören baserat på graden av bakgrund självlysande signalintensitet. Vi föredrar att använda "Radiance" inställningen snarare än "räknas" som utdatavärden för bioluminiscent signal.
- Exportera ROI resultaten i Excel och bestämma det högsta bakgrunden justerade självlysande signal för varje mus.
- Upprepa bioluminescent avbildning som anges för seriell övervakning av tumörtillväxt. I våra experiment, utför vi varje vecka bli. Vi föredrar att bestämma maximala BLI signalen för en given avbildning session genom att ta frekventa exponeringar under 5 - 30 minuter efter injektion av D-luciferin.
D. Representativa resultat
Denna stereotaktiska implantering teknik är förknippad med en framgångsrik tumör-ta ränta av 90-100% och med låg perioperativ mortalitet som vanligen är mindre än 5%. Risken för oavsiktliga biverkningar är också låg med denna teknik, inklusive sådana komplikationer som sådd av ryggmärgen från tumörceller implanterade i ventriklarna eller extrakraniell tumörtillväxt från antingen sådd av snittet med tumörceller eller otillräcklig stängning av borrhålet enllowing intrakraniell tumör för att expandera genom öppningen i skallen.
Ex vivo analys av tumörxenotransplantat visade förväntade områden av hypoxi, ökad VEGF uttryck och nekros. Fluorescensmikroskopi för grönt fluorescerande protein (GFP) uttrycks stabilt av vår GBM cellinje visade infiltrativ naturen hos dessa xenotransplantat.
Figur 1 visar resultaten av en typisk framgångsrik stereotaktisk implantation av GBM celler i hjärnan hos en mus. Detta är en T2-viktad hjärna MRT av en mushjärna utförs med en 9,4 Tesla magnet 21 dagar efter implantation med den teknik som beskrivs här. Figur 1 visar ett enda fokus av tumör i den högra hjärnhalvan (konturerad i rosa) mäter 19 mm 3 som lokaliserar till de exakta koordinaterna av implantationsstället.
Figur 2 visar resultaten av självlysande avbildning med Techn iques beskrivs här för en grupp av 10 möss med stereotaktiskt implanterade tumörer som var jämnt skiktad utifrån maximal självlysande signalintensitet att få antingen kraniell bestrålning (4 Gy x 4 dagliga fraktioner) eller ingen behandling alls. I detta experiment, visar bioluminescent avbildning att strålbehandling hämmar proliferation av de implanterade tumörerna, vilket resulterar i ingen ökning i den detekterade signalen bioluminescent, medan signalen ökar väsentligt i mock-bestrålade kontroll tumörer, på grund av okontrollerad proliferation av cancercellerna.
Figur 1 (Video). Koronala MRI delar av en mus hjärna innehåller en U251 tumör glioblastoma multiforme med konturering av tumörvolymen (i rosa). Skanningen utfördes med hjälp av en spin eko T2 viktade protokoll på en 9,4 Tesla skanner. Klicka här för att se filmen .
re 2 "src =" / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg "/>
Figur 2. 10 möss med stereotaktiskt implanterade tumörer glioblastoma multiforme behandlades med antingen extern strålbehandling till 16 Gy på 4 fraktioner eller ingen behandling. Möss avbildades med självlysande avbildning före behandling och varje vecka efter start av behandlingen. Diagrammet visar relativa bioluminiscens beräknad som medianvärde faldig förändring där faldig förändring definieras som förhållandet mellan nuvarande maximala BLI värde före behandling maximala BLI värde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden för stereotaktisk implantation av cancerceller hos möss som beskrivs i detta dokument genererar reproducerbart tumörer som rimligen sammanfatta de infiltrativ och snabb tillväxt mönster av klinisk glioblastoma multiforme 2, 6-8. Denna teknik är särskilt väl lämpad för experiment stratifiera möss jämnt till olika behandlingsgrupper där reproducerbara tumörer av jämförbar storlek och biologiska egenskaper och i vissa anatomiska ställen är önskvärda. Stereotaktisk implantation av tumörceller genom att använda tekniker som vi beskriver bör vara lätt uppnås av de flesta translationella forskningslaboratorier 7,9-11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Dr Andrew Hollander, Sara Davis, Lee Shuman, Tim Jenkins, och Dr Xiangsheng Xu för deras experthjälp. Vi erkänner stöd av Dr Ann Kennedy. BCB stöddes på Strålningsbiologi Training Grant C5T32CA009677. JFD stöddes på Burroughs Wellcome Karriär Award för medicinska forskare (1.006.792). JLB stöddes på supers bidrag (5 R25 CA140116-03). Vi vill tacka för Dr Steve Hahn vars uppmuntran och stöd har bidragit till att göra vår forskning möjlig. Vi vill också tacka University of Pennsylvania Nano-Bio Interface Center (NBIC) och Dr Dennis Discher för uppmuntran och värdefulla kommentarer. Vi erkänner liten anläggning Animal Imaging (SAIF) vid University of Pennsylvania för användning av deras MR-och optisk / Bioluminescens Core Facilities. Dessa tekniker har utvecklats som en del av projekt som stöddes av National Institutes of Health (RC1 CA145075 och K08 NS076548-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic platform for mouse implantation |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| Puralube Vet Ointment (ophthalmic) | Amazon.com | To prevent drying of the mouse's eyes | |
| drill holder for the stereotactic platform | Stoelting | 51681 | |
| Micromotor Electric Drill | Stoelting | 51449 | For drilling through the skull |
| .45 mm carbide drill bit | Stoelting | 514551 | |
| Sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Glass bead dry sterilizer (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER-5287 | To sterilize metal surgical instruments |
| Mouse rectal probe | Braintree Scientific | RET-3-ISO | Compatible with the temperature controller |
| Temperature Controller (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Temperature controller to maintain animal's temperature during surgery |
| Small heating plate | Harvard Apparatus | 727617 | For use with temperature controller to warm mouse during surgery. The heating plate fits under the mouse on the stereotaxic platform. |
| Disposable Scalpels | BD Bard-Parker | 2015-11 | #10 scalpel |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | For injection of tumor cells |
| 30 gauge needles, 1" long, with flat point | Hamilton | Various | Must be compatible with the 10 μl syringe |
| Nanomite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704507 | Digital motorized syringe injector for stereotaxic device |
| Cellulose sterile surgical spear sponges | Ultracell | 40410 | To dry the surgical field |
| Bone wax | Ethicon | W31 | To seal the burr hole |
| Tissumend II synthetic absorbable tissue adhesive | Veterinary Products Laboratories | 3002931 | To seal the incision |
| Hot water pump with warming pad | Gaymar | TP-650 | Warms mice in post-operative period |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | Luciferin for bioluminescent imaging |
References
- Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro. 3, e00063 (2011).
- Shelton, L. M. A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion. J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).
- Brehar, F. M. The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain. J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Radaelli, E. Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease. Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).
- Baumann, B. C. Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy. , Submitted (2012).
- Baumann, B. C. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). Transl. Oncol. , Forthcoming (2012).
- Park, S. S. MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).
- Szentirmai, O. Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect. Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).
- Dinca, E. B. Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy. J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).
