Summary
Aislamiento de linfocitos utilizando el kit de Miltenyi MAC es una manera confiable para purificar las células de todo homogeneizados de tejido linfoide. Células purificadas utilizando el sistema de Miltenyi suelen ser ≥ 96% de pureza. Este sentido, demuestran las medidas adoptadas para aislar las células CD4 + T, uno de los kits que se ofrecen por Miltenyi.
Abstract
Aislamiento de las células de la fuente primaria es un paso necesario en muchos protocolos más complejos. Miltenyi ofrece kits para aislar las células de varios organismos incluyendo los humanos, primates no humanos, ratas y, como se describe aquí ratones. Con bolas magnéticas basadas en la separación de células permite, ya sea para la selección positiva (o agotamiento de las células), así como la selección negativa. Este sentido, demuestran la selección negativa de CD4 he tocado ni na + células T colaboradoras. El uso de este protocolo estándar que suele purificar las células que son CD4 ≥ 96% puro + / CD3 +. Este protocolo se utiliza en conjunción con el protocolo de disección y 2-Photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones publicado en el número 7 de Jove, para la purificación de las células T y otros tipos de células para la transferencia adoptiva con fines de imagen. A pesar de que no demostró el análisis FACS en este video de protocolo, se recomienda comprobar la pureza total de células aisladas con los anticuerpos apropiados a través de la FACS. Además, se demuestra que el método no estéril de aislamiento de células T. Si las células estériles son necesarios para su particular aplicación de usuario final, asegúrese de hacer todos los procedimientos se demuestra en la capilla de cultivo de tejidos en condiciones estándar de estéril. Gracias por su atención y buena suerte con tus propios experimentos!
Protocol
Por favor, lea y siga el protocolo incluido en el kit de Miltenyi o en línea en http://www.miltenyibiotec.com/ .
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Discussion
Aislamiento de las células de la fuente primaria es un paso necesario en muchos protocolos más complejos. Miltenyi ofrece kits para aislar las células de varios organismos incluyendo los humanos, primates no humanos, ratas y, como se describe aquí ratones. Con bolas magnéticas basadas en la separación de células permite, ya sea para la selección positiva (o agotamiento de las células), así como la selección negativa. Este sentido, demuestran la selección negativa de CD4 he tocado ni na + células T colaboradoras. El uso de este protocolo estándar que suele purificar las células que son CD4 ≥ 96% puro + / CD3 +. A pesar de que no demostró el análisis FACS en este video de protocolo, se recomienda comprobar la pureza total de células aisladas con los anticuerpos apropiados a través de la FACS. Además, se demuestra que el método no estéril de aislamiento de células T. Si las células estériles son necesarios para su particular aplicación de usuario final, asegúrese de hacer todos los procedimientos se demuestra en la capilla de cultivo de tejidos en condiciones estándar de estéril.
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Acknowledgments
Queremos agradecer a Rebecca Paquett para la preparación de buffer MACS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
