Summary
عزل الخلايا الليمفاوية باستخدام بالاعمال Miltenyi المجموعة هو وسيلة موثوق بها لتنقية الخلايا من الأنسجة اللمفاوية الخليط كله. تنقية الخلايا باستخدام نظام Miltenyi عادة ≥ 96 ٪ نقية. هنا ، ونحن لشرح الخطوات التي اتخذت لعزل خلايا CD4 + T ، واحدة من مجموعات كثيرة تقدمها Miltenyi.
Abstract
عزل الخلايا من المصدر الأساسي هو خطوة ضرورية في العديد من البروتوكولات أكثر تعقيدا. Miltenyi تقدم مجموعات لعزل الخلايا من الكائنات الحية بما في ذلك العديد من البشر ، والرئيسات غير البشرية ، والجرذان ، كما وصفنا هنا الفئران. الفصل المغناطيسي خلية حبة المستندة يسمح لاختيار إما إيجابية (أو نضوب الخلية) ، وكذلك اختيار سلبية. هنا ، علينا أن نظهر التحديد السلبي للCD4 لقد يمسها أو غ + خلايا T المساعدة. باستخدام هذا البروتوكول القياسي نحن عادة تنقية الخلايا التي يتم CD4 ≥ النقي بنسبة 96 ٪ + / + CD3. ويستخدم هذا البروتوكول بالاقتران مع بروتوكول تشريح و 2 الفوتون التصوير من العقد الليمفاوية الطرفية في الفئران التي نشرت في العدد 7 من إن الرب ، لتنقية الخلايا T وغيرها من أنواع الخلايا لنقل adoptively لأغراض التصوير. على الرغم من أننا لم تثبت FACS التحليل في هذا الفيديو البروتوكول ، فإنه يوصى بشدة للتأكد من نقاء الشاملة للخلايا معزولة باستخدام الأجسام المضادة المناسبة عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية. بالإضافة إلى ذلك ، علينا أن نظهر الأسلوب غير معقمة من العزلة الخلايا التائية. إذا كانت هناك حاجة الخلايا العقيمة للتطبيق نهاية مستخدم معين ، يجب التأكد من القيام بكل الإجراءات التي تجلت في نسيج الثقافة غطاء تحت ظروف معقمة القياسية. أشكركم على مشاهدة ونتمنى لك التوفيق في التجارب الخاصة بك!
Protocol
يرجى قراءة واتباع البروتوكول تدرج في عدة Miltenyi أو عبر الإنترنت في http://www.miltenyibiotec.com/ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عزل الخلايا من المصدر الأساسي هو خطوة ضرورية في العديد من البروتوكولات أكثر تعقيدا. Miltenyi تقدم مجموعات لعزل الخلايا من الكائنات الحية بما في ذلك العديد من البشر ، والرئيسات غير البشرية ، والجرذان ، كما وصفنا هنا الفئران. الفصل المغناطيسي خلية حبة المستندة يسمح لاختيار إما إيجابية (أو نضوب الخلية) ، وكذلك اختيار سلبية. هنا ، علينا أن نظهر التحديد السلبي للCD4 لقد يمسها أو غ + خلايا T المساعدة. باستخدام هذا البروتوكول القياسي نحن عادة تنقية الخلايا التي يتم CD4 ≥ النقي بنسبة 96 ٪ + / + CD3. على الرغم من أننا لم تثبت FACS التحليل في هذا الفيديو البروتوكول ، فإنه يوصى بشدة للتأكد من نقاء الشاملة للخلايا معزولة باستخدام الأجسام المضادة المناسبة عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية. بالإضافة إلى ذلك ، علينا أن نظهر الأسلوب غير معقمة من العزلة الخلايا التائية. إذا كانت هناك حاجة الخلايا العقيمة للتطبيق نهاية مستخدم معين ، يجب التأكد من القيام بكل الإجراءات التي تجلت في نسيج الثقافة غطاء تحت ظروف معقمة القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نشكر ريبيكا Paquett لإعداد MACS العازلة.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
