Summary
Isolation von Lymphozyten mit der Miltenyi MACs Kit ist eine zuverlässige Methode, um Zellen aus ganzen lymphatischen Gewebe-Homogenaten zu reinigen. Cells unter Verwendung der Miltenyi-System sind in der Regel ≥ 96% rein. Hier zeigen wir, welche Schritte unternommen wurden, um CD4 + T-Zellen, einer der vielen Kits von Miltenyi angeboten isolieren.
Abstract
Isolierung von Zellen aus der Primärquelle ist ein notwendiger Schritt in viele weitere komplexe Protokolle. Miltenyi bietet Kits, um Zellen aus verschiedenen Organismen einschließlich des Menschen, nicht-menschlichen Primaten, Ratten-und, wie wir hier beschreiben, Mäuse zu isolieren. Magnetic Bead-basierten Zellseparation können entweder für eine positive Selektion (oder Zell-Depletion) sowie negative Selektion. Hier zeigen wir, negative Selektion von unberührter oder na ve CD4 + T-Helferzellen. Mit diesem Standard-Protokoll haben wir in der Regel zu reinigen Zellen, die ≥ 96% reine CD4 + / CD3 + sind. Dieses Protokoll ist in Verbindung mit dem Protokoll Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen in Heft 7 des Jupiter veröffentlicht, für die Reinigung von T-Zellen und anderen Zelltypen zu adoptiv für bildgebende Zwecke übertragen werden. Obwohl wir nicht zeigen, FACS-Analyse in diesem Protokoll video, ist es dringend empfohlen, die gesamte Reinheit der isolierten Zellen mit den entsprechenden Antikörpern via FACS überprüfen. Darüber hinaus zeigen wir die nicht-sterile Methode der T-Zell-Isolierung. Wenn sterile Zellen für Ihre Endbenutzer-Anwendung benötigt werden, sollten Sie alle bewiesen Verfahren in der Gewebekultur Haube unter Standard-sterilen Bedingungen zu tun. Wir danken Ihnen für das Ansehen und viel Glück mit Ihrem eigenen Experimenten!
Protocol
Bitte lesen und befolgen das Protokoll in der Miltenyi-Kit oder online unter einbezogen http://www.miltenyibiotec.com/ .
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Discussion
Isolierung von Zellen aus der Primärquelle ist ein notwendiger Schritt in viele weitere komplexe Protokolle. Miltenyi bietet Kits, um Zellen aus verschiedenen Organismen einschließlich des Menschen, nicht-menschlichen Primaten, Ratten-und, wie wir hier beschreiben, Mäuse zu isolieren. Magnetic Bead-basierten Zellseparation können entweder für eine positive Selektion (oder Zell-Depletion) sowie negative Selektion. Hier zeigen wir, negative Selektion von unberührter oder na ve CD4 + T-Helferzellen. Mit diesem Standard-Protokoll haben wir in der Regel zu reinigen Zellen, die ≥ 96% reine CD4 + / CD3 + sind. Obwohl wir nicht zeigen, FACS-Analyse in diesem Protokoll video, ist es dringend empfohlen, die gesamte Reinheit der isolierten Zellen mit den entsprechenden Antikörpern via FACS überprüfen. Darüber hinaus zeigen wir die nicht-sterile Methode der T-Zell-Isolierung. Wenn sterile Zellen für Ihre Endbenutzer-Anwendung benötigt werden, sollten Sie alle bewiesen Verfahren in der Gewebekultur Haube unter Standard-sterilen Bedingungen zu tun.
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Acknowledgments
Wir wollen Rebecca Paquett für die Herstellung von MACS-Puffer zu danken.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
