Summary
בידוד של לימפוציטים באמצעות MACS Miltenyi ערכת מהווה דרך אמינה לטהר תאים שלמים homogenates רקמת הלימפה. תאים מטוהרים באמצעות מערכת Miltenyi הם בדרך כלל ≥ 96% טהור. הנה, אנחנו מדגימים את הצעדים שננקטו כדי לבודד תאים מסוג CD4 + T, אחת ערכות רבים המוצעים על ידי Miltenyi.
Abstract
בידוד של תאים ממקור העיקרית היא צעד הכרחי פרוטוקולים מורכבים הרבה יותר. Miltenyi מציעה ערכות לבודד תאים ואורגניזמים מספר כולל בני אדם, שאינם בני אדם וקופים, חולדות, כפי המתואר כאן, בעכברים. הפרדה מגנטית חרוז מבוססי תאים מאפשר בחירה או חיובי (או דלדול התא), כמו גם סלקציה שלילית. הנה, אנחנו מדגימים סלקציה שלילית של CD4 יש נגעה או Na + עוזר ותאי T. שימוש זה הפרוטוקול הסטנדרטי שאנחנו בדרך כלל לטהר את התאים CD4 ≥ טהור 96% + / CD3 +. פרוטוקול זה נמצא בשימוש בשילוב עם Dissection הפרוטוקול 2-Photon הדמיה של בלוטות לימפה הפריפריה עכברים שפורסם בגיליון 7 של יופיטר, לטיהור בתאי T סוגי תאים אחרים adoptively להעביר למטרות הדמיה. למרות שאנו לא להפגין ניתוח FACS וידאו בפרוטוקול זה, מומלץ מאוד לבדוק את טוהר הכולל של תאים בודדים באמצעות נוגדנים מתאימים באמצעות FACS. בנוסף, אנחנו מדגימים את השיטה הלא סטרילית של בידוד תא T. אם התאים סטרילי נחוצות עבור יישום מסוים של משתמש הקצה שלך, הקפד לעשות את כל ההליכים הפגינו למכסה המנוע בתרבית רקמה בתנאים סטריליים סטנדרטי. אנו מודים לך על צפייה ובהצלחה עם הניסויים שלך!
Protocol
אנא קרא ופעל על פי פרוטוקול כלול בערכה Miltenyi או באופן מקוון http://www.miltenyibiotec.com/ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בידוד של תאים ממקור העיקרית היא צעד הכרחי פרוטוקולים מורכבים הרבה יותר. Miltenyi מציעה ערכות לבודד תאים ואורגניזמים מספר כולל בני אדם, שאינם בני אדם וקופים, חולדות, כפי המתואר כאן, בעכברים. הפרדה מגנטית חרוז מבוססי תאים מאפשר בחירה או חיובי (או דלדול התא), כמו גם סלקציה שלילית. הנה, אנחנו מדגימים סלקציה שלילית של CD4 יש נגעה או Na + עוזר ותאי T. שימוש זה הפרוטוקול הסטנדרטי שאנחנו בדרך כלל לטהר את התאים CD4 ≥ טהור 96% + / CD3 +. למרות שאנו לא להפגין ניתוח FACS וידאו בפרוטוקול זה, מומלץ מאוד לבדוק את טוהר הכולל של תאים בודדים באמצעות נוגדנים מתאימים באמצעות FACS. בנוסף, אנחנו מדגימים את השיטה הלא סטרילית של בידוד תא T. אם התאים סטרילי נחוצות עבור יישום מסוים של משתמש הקצה שלך, הקפד לעשות את כל ההליכים הפגינו למכסה המנוע בתרבית רקמה בתנאים סטריליים סטנדרטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מבקשים להודות רבקה Paquett להכנת חיץ MACS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
