Summary
Выделение лимфоцитов с использованием набора Miltenyi ПДК является надежным способом очищают клетки от целых лимфоидной гомогенатах ткани. Клетки очищали с использованием системы Miltenyi, как правило, ≥ 96% чистой. Здесь мы демонстрируем, шаги, предпринятые для изоляции CD4 + Т-клеток, одна из многих комплектов, предлагаемых Miltenyi.
Abstract
Изоляция клеток от первичного источника является необходимым шагом во многих более сложных протоколов. Miltenyi предлагает комплекты для изоляции ячеек нескольких организмов, включая человека, не человеческих приматов, крысы и, как мы описываем здесь, мыши. Магнитный шарик-ячейкой на основе разделения позволяет либо положительного отбора (или элементов истощения), а также негативный отбор. Здесь мы показываем негативный отбор нетронутой или наивны CD4 + Т-клетки. Используя этот стандартный протокол мы обычно очищают клетки, которые ≥ 96% чистой CD4 + / CD3 +. Этот протокол используется в сочетании с Dissection протокол и 2-Фотон изображений периферических лимфатических узлов у мышей опубликована в выпуске 7 Юпитера, для очистки Т-клеток и другие типы клеток, чтобы восприимчиво передачу для работы с изображениями целей. Хотя мы не продемонстрировали FACS анализ в этом видео протокол, настоятельно рекомендуется проверить общую чистоту изолированных клеток с использованием соответствующих антител с помощью FACS. Кроме того, мы демонстрируем нестерильный способ выделения Т-клеток. Если стерильные клетки необходимы для конкретного конечного пользователя приложения, убедитесь, что сделали все продемонстрировали процедур в капюшоне культуры ткани при стандартных стерильных условиях. Спасибо за внимание и удачи в ваших собственных экспериментов!
Protocol
Пожалуйста, прочитайте и следуйте протокол, входящий в комплект Miltenyi или на сайте http://www.miltenyibiotec.com/ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изоляция клеток от первичного источника является необходимым шагом во многих более сложных протоколов. Miltenyi предлагает комплекты для изоляции ячеек нескольких организмов, включая человека, не человеческих приматов, крысы и, как мы описываем здесь, мыши. Магнитный шарик-ячейкой на основе разделения позволяет либо положительного отбора (или элементов истощения), а также негативный отбор. Здесь мы показываем негативный отбор нетронутой или наивны CD4 + Т-клетки. Используя этот стандартный протокол мы обычно очищают клетки, которые ≥ 96% чистой CD4 + / CD3 +. Хотя мы не продемонстрировали FACS анализ в этом видео протокол, настоятельно рекомендуется проверить общую чистоту изолированных клеток с использованием соответствующих антител с помощью FACS. Кроме того, мы демонстрируем нестерильный способ выделения Т-клеток. Если стерильные клетки необходимы для конкретного конечного пользователя приложения, убедитесь, что сделали все продемонстрировали процедур в капюшоне культуры ткани при стандартных стерильных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Ребекка Paquett для подготовки буфера MACS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
