Summary
Transmembrana della fibrosi cistica regolatore conduttanza (CFTR), un canale cloruro epiteliale, è stata riportata per interagire con varie proteine e regolano importanti processi cellulari, tra i quali i CFTR PDZ motivo mediate da interazioni sono stati ben documentati. Questo protocollo descrive i metodi che abbiamo sviluppato per assemblare un PDZ-dipendente macromolecolare CFTR segnalazione complessa
Abstract
Transmembrana della fibrosi cistica regolatore della conduttanza (CFTR), un canale del cloro si trova soprattutto a livello delle membrane apicali delle cellule epiteliali, gioca un ruolo cruciale nella omeostasi del liquido transepiteliale 1-3. CFTR è stata implicata in due importanti malattie: fibrosi cistica (CF) 4 e 5 secretoria diarrea. In CF, la sintesi o attività funzionale della CFTR Cl-canale è ridotta. Questo disturbo colpisce circa 1 su 2500 caucasici negli Stati Uniti 6. Attività eccessiva CFTR è stata anche implicata in casi di tossina indotta diarrea secretoria (ad esempio, da tossina del colera e stabile al calore enterotossina E. coli) che stimola la produzione di cAMP o cGMP nell'intestino 7.
Accumulare le prove suggeriscono l'esistenza di interazioni fisiche e funzionali tra CFTR e un numero crescente di altre proteine, tra trasportatori, canali ionici, recettori, chinasi, fosfatasi, segnalemolecole zione ed elementi del citoscheletro, e queste interazioni tra CFTR e le sue proteine leganti hanno dimostrato di essere criticamente coinvolte nella regolazione CFTR trasporto mediato transepiteliale ionico in vitro e in vivo 8-19. In questo protocollo, ci concentriamo solo sui metodi che gli aiuti nello studio delle interazioni tra CFTR carbossile terminale della coda, che possiede una proteina di legame motivo [denominato PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], e un gruppo di proteine scaffold, che contengono un modulo di legame specifico denominato domini PDZ. Finora, molte diverse proteine PDZ ponteggi sono stati riportati da associare alla coda terminale carbossile di CFTR con affinità diverse, ad esempio, i NHERF1 NHERF2 e PDZK1 e PDZK2 e CAL (CFTR-associata ligando), Shank2, e GRASP 20-27. Il motivo PDZ all'interno CFTR che è riconosciuto da PDZ proteine scaffold è ultimi quattro amminoacidi al C terminale (cioè, 1477-DTRL-1480 in umano CFTR) 20. Interessante,CFTR può legare più di un dominio PDZ sia NHERFs e PDZK1, pur in diversi affinità 22. Questa polivalenza rispetto CFTR legame ha dimostrato di essere di importanza funzionale, suggerendo che le proteine PDZ impalcatura può facilitare la formazione di complessi macromolecolari CFTR segnalazione per la segnalazione specifici / selettivo ed efficace in cellule 16-18.
Più saggi biochimici sono stati sviluppati per studiare CFTR, che coinvolge interazioni proteiche, come la co-immunoprecipitazione, pull-down assay, pair-wise saggio di legame, colorimetrico pair-wise saggio di legame, e il dosaggio di assemblaggio macromolecolare complessa 16-19,28,29 . Qui ci concentriamo sulle procedure dettagliate di assemblaggio di un motivo PDZ CFTR-dipendente contenenti macromolecole complesse in vitro, che è ampiamente utilizzato dal nostro laboratorio per studiare proteina-proteina o di dominio nel dominio delle interazioni che coinvolgono CFTR 16-19,28,29.
Protocol
1. Espressione e purificazione di proteine ricombinanti in batteri Fusion etichettate
- Amplifica le regioni definite del C-code (gli ultimi 50-100 aminoacidi contenenti i motivi PDZ a C-terminale) per CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, e NHERFs (full-length o PDZ1 o PDZ2 domini ) con approccio PCR.
- Clonare i prodotti di PCR in pGEX4T-1 vettore per le proteine di fusione GST-(come GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-C2 vettore per MBP-fusione proteine (come MBP-β 2 AR CT, MBP-CFTR CT ), e per i Suoi pET30-S-proteine di fusione (come la sua-S-CFTR CT, His-S-PDZK1).
- Trasforma in una proteasi carente di E. coli ceppo (BL21-DE3) per ridurre al minimo possibile degradazione della proteina ricombinante.
- Crescere la coltura di una notte a 37 ° C in terreno Luria-Bertani (pH 7,0) contenente antibiotici adatti (come ampicillina o kanamicina). Diluire la coltura di una notte a 1:10 e crescere per altre 2 ore a 37 ° C. Indurre con 0,5-1 m M IPTG per i prossimi 4 ore a 30 ° C. Pellet delle cellule per centrifugazione a 8000 g per 10 min a 4 ° C.
- Lisare le cellule in tampone saccarosio (50 m M Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, e 10% di saccarosio) contenente lisozima (1 mg / mL), 0,2% Triton X-100, e proteasi inibitori. Usare 20 mL per pellet di cellule proveniente da 1 L della cultura.
- Mescolare su un agitatore rotante per 30 minuti a 4 ° C.
- Spin a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante chiaro.
- Nel supernatante chiaro, aggiungere 1 ml delle seguenti resina / agarosio perline (50% slurry in tampone saccarosio):
- Glutatione perline di agarosio per proteine di fusione GST.
- Perle Talon per le Sue S-proteine di fusione.
- Resina amilosio per proteine di fusione MBP.
- Mescolare per 4 ore a 4 ° C su un agitatore rotante.
- Lavare le perle risospendendo in 1x PBS (15 ml), mescolare per 2 min, filatura a 800 g per 2 min, e scartando il supernatante. Ripetere questo passaggio per sei volte.
- Eluire la proteina dalle perline mediante rispettivo buffer di eluizione (2 mL di tampone di eluizione per 1 mL di perline).
- Tampone di eluizione per proteine di fusione GST: 25 m M Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M NaCl, e 20 m M glutatione ridotto.
- Tampone di eluizione per le sue proteine di fusione: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M NaCl, e 200 mM imidazolo.
- Tampone di eluizione per proteine di fusione MBP: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, e 10 mM maltosio.
- Dializzare le proteine eluite contro 2 L di 1x PBS a 4 ° C (per evitare la possibile degradazione delle proteine). Sostituire ogni 4 ore per quattro volte PBS. Concentrare la proteina utilizzando un filtro Centricon (10.000 taglio MW, Millipore), e memorizza come piccole aliquote a -80 ° C.
- Determellino la concentrazione di proteina mediante il metodo Bradford. Valutare qualità delle proteine mediante SDS-PAGE usando BSA come standard. Se l'integrità della proteina non è soddisfacente, le procedure di purificazione secondarie, come la filtrazione su gel o scambio ionico possono essere utilizzati. (Ad esempio, abbiamo utilizzato una colonna G-75 Sepharose per purificare ulteriormente-proteina di fusione GST).
2. Di coltura cellulare e Preparazione del lisato cellulare
- Bambino Cultura renali di criceto (BHK) stabilmente cellule che over-esprimono CFTR-peso e CFTR-his10 o cellule BHK transitoriamente che over-esprimono Flag-LPA 2-peso o Flag-LPA 2-ΔSTL e Madin-Darby rene canino (MDCK stabilmente) cellule che sovra-esprimono MRP2 in mezzo minimo essenziale di Eagle (MEM) contenente 10% siero di vitello fetale e penicillina / streptomicina in fiasche di polistirene a 37 ° C con 5% CO 2.
- Cultura embrionali umane di rene (293 HEK293) stabilmente cellule che over-esprimono CFTR-peso e CFTR-his10 in Dulbecco'S mezzo Eagle modificato (DMEM) integrato con 10% siero fetale bovino e penicillina / streptomicina in fiasche di polistirene a 37 ° C con 5% CO 2.
- Lisare le cellule in tampone di lisi (PBS - 0,2% Triton-X-100 integrato con una miscela di inibitori di proteasi contenenti 1 mM fenilmetilsolfonilfluoruro, 1 ug / ml di aprotinina, 1 ug / mL di leupeptina, 1 ug / ml di pepstatina); uso 500 tampone di lisi microlitri per ogni 60 mm piastra di Petri, e 1000 tampone di lisi microlitri per ogni 100 mm piastra di Petri.
- Rock the lisati cellulari per 20 min a 4 ° C, e rimuovere il materiale insolubile mediante centrifugazione a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C. Determinare la concentrazione proteica con il saggio Bradford.
3. In Assemblea in vitro di un CFTR contenente complesso macromolecolare (CFTR-PDZK1-MRP4)
- In 200 microlitri di tampone di lisi (PBS - 0,2% Triton X-100 + inibitori della proteasi), aggiungere 20 mcg purificato GST-MRP4 C-terminale50 bis (CT50), proteina di fusione.
- Aggiungi vari importi (0-40 mg) di purificata His-S-PDZK1 proteina di fusione.
- Mescolare le due proteine su un agitatore rotante a 22 ° C per 1-2 h.
- Aggiungi 20 perle del glutatione pl (50% slurry) nella miscela di proteine, e continuare a mescolare per un altro 1 h. Questa fase viene anche indicato come a coppie legante.
- Durante questo tempo, preparare le HEK293 lisati cellulari che iperesprimono Flag-CFTR (wt) come sopra descritto al punto 2).
- Lavare il complesso due volte con tampone di lisi. Spin a 800 xg per 1 minuto per ogni lavaggio e aspirare accuratamente il supernatante dopo ogni lavaggio. Prestare attenzione a non succhiare le perline in fondo.
- Aggiungere preparato sopra lisati cellulari HEK293 alle perle, e mescolare delicatamente a 4 ° C per 3 h (o tutta la notte).
- Lavare le perline estesamente tre volte con tampone di lisi, come descritte nella Fase 3,6).
- Eluire le proteine con 30 microlitri Sample Buffer (5 ×): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), 50% glicerolo, 2% SDS, e 0,1% blu di bromofenolo, contenente 5% di β-mercaptoetanolo.
- Incubare in bagnomaria a 37 ° C per 10-15 min, e far girare a 5000 × g per 30 s per far precipitare le perline.
- Caricare tutto l'eluato su gel 4-15%.
- Eseguire SDS-PAGE per circa 30-40 min.
- Trasferimento bande proteiche alla membrana PVDF, per 1,5 ore.
- Bloccare la membrana in TBS-Tween contenente 5% di latte non grasso.
- Incubare la membrana con l'anticorpo primario (ad esempio anti-IgG CFTR, R1104) a 4 ° C, una notte.
- Lavare la membrana con TBS-Tween per 5 min, sei volte.
- Incubare la membrana con anticorpo secondario (come capra anti-topo coniugato HRP-anticorpo 2 °) per 45 min a 22 ° C.
- Lavare la membrana con TBS-Tween per 5 min, sei volte.
- Visualizzare le bande proteiche tramite ECL.
- I dati rappresentativi sono mostrati in Figura 1.
Un esempio di CFTR contenente complesso macromolecolare segnalazione che è stata assemblata in vitro è illustrato nella figura 1. Un complesso macromolecolare è formata tra MRP4 C-terminale di 50 amminoacidi (MRP4-CT50), PDZK1 e full-length CFTR (Figura 1, in basso). La formazione del complesso aumento dose-dipendente con quantità crescenti di proteina intermediario, PDZK1 (Figura 1, in basso) 18.
Figura 1. Una rappresentazione pittorica del saggio complesso macromolecolare (in alto). Un complesso macromolecolare è stato rilevato in vitro con tre proteine (GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1, e Flag-CFTRwt) in un modo dipendente dalla dose (in basso) 18.
| CFTR-NHERF2-LPA 2 (rif. 15) | CFTR-PDZ proteine MRP-2 (rif. 17) | CFTR-PDZK1-MRP4 (rif. 16) | ||
| Affinity perline | Amilosio resina | S-proteina agarosio | Amilosio resina | Glutatione agarosio |
| Proteina purificata-1 | MBP-β 2 AR CT | His-S-CFTR CT | MBP-CFTR CT | GST-MRP4 CT |
| Proteina purificata-2 | GST-NHERF1 | GST-NHERF2 | GST-proteine PDZ | His-S-PDZK1 |
| Proteina purificata-3 (o lisati cellulari) | CFTR-peso o CFTR-his10 (BHK o lisati cellulari HEK) | BandieraLPA-2-peso o Flag-LPA 2-ΔSTL (lisati cellulari BHK) | MRP2 (lisati cellulari MDCK) | Purificata Flag-CFTR wt-o-CFTR his10 (o lisati cellulari) |
| Anticorpo | Anti-IgG CFTR | Anti-Flag HRP | Anti-IgG MRP2 | Anti-Flag HRP |
Tabella 1. Sintesi di vari CFTR contenenti complessi macromolecolari assemblati in vitro.
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Discussion
In questo protocollo abbiamo dimostrato un metodo in vitro per l'assemblaggio e il rilevamento di una CFTR contenente complesso macromolecolare segnalazione utilizzando proteine purificate (o frammenti di proteine) e / o lisati di cellule come riportato precedentemente 16-19,29,30. Per ottenere i migliori risultati i seguenti punti critici durante il processo di preparazione richiedono una particolare attenzione:
- È importante che il pH del tampone di eluizione essere regolata a 8,0 dopo l'aggiunta di glutatione ridotto quando la purificazione del GST-proteina di fusione, come descritto nel passaggio 1). Il pH può essere la più bassa 3,0 dopo l'aggiunta di glutatione ridotto. Se il pH non è regolata prima eluizione, l'efficienza di eluizione è drasticamente ridotto.
- Quando la proteina è eluita dalle perline, devono essere dializzato subito, altrimenti, la proteina purificata potrebbe uscire della soluzione. Se la dialisi proteina non è possibile subito dopo il processo di eluizione, non eluire la proteina e lasciare con the agarosio / perline.
- Si raccomanda vivamente di non bollire le CFTR contenenti campioni complessi macromolecolari preparati per Western blot come CFTR aggregazione è un problema comune. Invece, i campioni devono essere riscaldati a 37 ° C per 10-15 minuti prima caricata nel gel.
- Per il complesso proteico interazione con bassa affinità, il immunoblot può essere osservata con SuperSignal Ovest Femto (o Pico) Sensibilità Substrato massima (Pierce) per aumentare il segnale.
La tecnica ha dimostrato qui offre un saggio pratico e riproducibile per definire biochimicamente uno CFTR contenente complesso terziaria della proteina. Ci sono diversi modi per assemblare in vitro complessi macromolecolari CFTR come indicato nella Tabella 1.
- Al fine di ottenere risultati convincenti, si dovrebbe cercare di assemblare il complesso in entrambi i modi, cioè i CFTR) - PDZ scaffold proteina (s) - la proteina terzo; ii) il terzo proteina - PDZ proteine scaffold (s) - CFTR.
- Per dimostrare l'PDZ motivo-dipendenza della formazione macromolecolare complesso, CFTR-his10 (CFTR-his10 contiene 10 suoi residui nel C-terminale della coda; questa proteina ha un motivo interno PDZ e non può legarsi NHERFs 29), le proteine con la loro motivi PDZ mutato o soppresso (ad esempio β-2 AR L413A; LPA 2-ΔSTL, etc) può essere utilizzato in parallelo nel dosaggio complesso macromolecolare pure.
- Invece di utilizzare i lisati di cellule intere che contengono anche molti altri componenti, si può usare proteine purificate (come la terza proteina) in 3,7-passo) (come nel montaggio di MRP4-PDZK1-CFTR, abbiamo utilizzato anche il purificato Flag-CFTR;. rif 18). Questo fornisce risultato convincente di un complesso unicamente tri-proteina, poiché vi sono solo tre proteine purificate contenute nel sistema di assemblaggio intero.
Tuttavia, il rilevamento del complesso macromolecolare CFTR in vitro utilizzando purifiEd (proteine o frammenti di proteine) o lisati da cellule che iperesprimono CFTR o le proteine che interagiscono non indica se il complesso macromolecolare di segnalazione presente in cellule che esprimono endogenamente queste proteine interagiscono. Per risolvere questo problema, co-immunoprecipitazione può essere eseguita per valutare i complessi CFTR nelle cellule endogene come le cellule epiteliali delle vie aeree 16 e cellule epiteliali intestinali 17,18. Inoltre, analisi di spettrometria di massa e 2-gel elettroforesi bidimensionale 29 può essere eseguito per identificare sconosciuti partner di legame per CFTR. Tuttavia, è oltre la portata di questo protocollo per dimostrare queste tecniche.
Inoltre, la localizzazione subcellulare di proteine interagenti in vivo può anche influenzare le interazioni molecolari. Ad esempio, MRP4 ha dimostrato di essere espresso in membrane sia apicali e basolaterale, mentre CFTR è localizzata principalmente alla membrana apicale, se sono stati demonstrated di interagire fisicamente e funzionalmente tra loro mediante la proteina PDZ scaffold PDZK1 18. Inoltre, l'iperespressione delle proteine ricombinanti, come utilizzato nel protocollo corrente, può influenzare la localizzazione subcellulare e consentono quindi di interazioni che altrimenti non si verificano. Tali possibilità dovrebbero essere presi in considerazione quando si interpretano i dati ed estrapolando i risultati.
Anche se il protocollo attuale si concentra sulla procedura per assemblare PDZ-dipendenti CFTR contenenti complessi macromolecolari, questo protocollo ha anche potenziali applicazioni per il montaggio non-CFTR coinvolti multi-proteina complessa (sia PDZ-dipendente o indipendente). Più recentemente, questo test assemblaggio macromolecolare, abbiamo dimostrato che un recettore di chemiochina CXCR2 fisicamente forma un complesso con la proteina a valle effettore PLCβ 2 mediata tramite NHERF1 in neutrofili, e questo CXCR2 complesso macromolecolare è funzionalerilevanza come interrompere il complesso (via utilizzando un peptide esogeno CXCR2) funzioni significativamente attenuati neutrofili 31.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Il nostro lavoro è stato supportato anche da finanziamenti American Heart Association (Greater Southeast Affiliate) Inizio-grant-in-aiuto 0765185B, la Fondazione U. Pardee Elsa assegno di ricerca, e Wayne State University intramurale del fondo di avvio e Cardiovascular Research Institute premio Initiative Isis. Questo metodo di assemblaggio in vitro complesso macromolecolare CFTR è stata originariamente introdotta da Dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
| pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
| Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon beads | Clontech | 635501 | |
| reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
| imidazole | Fisher | BP305-50 | |
| maltose | Fisher | BP684-500 | |
| S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
| Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
| Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
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References
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