Oprensning af Patogen vakuoler fra<em> Legionella</em>-Inficerede Fagocytter
Summary
Denne artikel beskriver en fremgangsmåde til isolering og oprensning af intakt<em> Legionella</em>-Holdige vakuoler (lette erhvervskøretøjer) fra amøbe og makrofager. To-trins protokol omfatter LCV berigelse af immuno-magnetisk separation under anvendelse af et antistof mod et bakterielt LCV markør og yderligere rensning ved densitetsgradientcentrifugering.
Abstract
Den opportunistisk patogen Legionella pneumophila er en amøbe-resistent bakterie, der også replikerer i alveolære makrofager dermed forårsager den alvorlige lungebetændelse "Legionærsyge" 1. I protozoer og pattedyr fagocytter, L. pneumophila anvender en konserveret mekanisme til dannelse af en specifik, replikations-eftergivende kammer, en "Legionella-holdige vakuolen" (LCV). LCV dannelse kræver bakterielle ICM / Dot type IV sekretionssystem (T4SS), der translokaliserer så mange som 275 "effektor"-proteiner i værtsceller. Effektorerne manipulere vært-proteiner såvel som lipider og kommunikere med sekretorisk, endosomale og mitokondrie organeller 2-4.
Dannelsen af lette erhvervskøretøjer repræsenterer en kompleks, robust og overflødige proces, som er vanskeligt at forstå en reduktionistisk måde. En integreret tilgang er påkrævet for at omfattende forstå LCV dannelse, herunder en samlet analyse af stienogen-vært faktor interaktioner og deres tidsmæssige og rumlige dynamik. Som et første skridt hen imod dette mål, er intakte lette erhvervskøretøjer oprenset og analyseret ved proteomics og lipidomics.
Sammensætning og dannelse af patogen-holdige vakuoler er blevet undersøgt ved proteomik analyse under anvendelse af væskekromatografi eller 2-D gelelektroforese koblet til massespektrometri. Vakuoler isoleret fra enten sociale jorden amøbe Dictyostelium discoideum eller mammale fagocytter husede Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, Salmonella 9 eller Legionella spp. 10. Men, rensning protokoller benyttet i disse undersøgelser er tidskrævende og kedelige, da de kræver fx elektronmikroskopi til at analysere LCV morfologi, integritet og renhed. Derudover har disse protokoller ikke udnytte særlige kendetegn patogenet vacuolen for enrichment.
Metoden præsenteres her overvinder disse begrænsninger ved at ansætte D. discoideum frembringelse af en fluorescerende LCV markør og ved at målrette det bakterielle effektorprotein proteinet SidC, som selektivt forankrer til LCV membranen ved at binde til phosphatidylinositol-4-phosphat (PtdIns (4) P) 3,11. Lette erhvervskøretøjer er beriget i et første trin ved immuno-magnetisk separation under anvendelse af et affinitetsoprenset primære antistof mod SidC og et sekundært antistof koblet til magnetiske perler, efterfulgt i et andet trin ved en klassisk Histodenz densitetsgradientcentrifugering 12,13 (fig. 1) .
En proteom undersøgelse af isolerede lette erhvervskøretøjer fra D. discoideum afslørede mere end 560 værtscelleproteiner, herunder proteiner associeret med fagocytiske vesikler, mitokondrier, ER og Golgi samt adskillige GTPaser, som ikke er blevet impliceret i LCV dannelse før 13. Lette erhvervskøretøjer beriget og oprenset medprotokollen beskrevet her, kan yderligere analyseres ved mikroskopi (immunfluorescens, elektronmikroskopi), biokemiske metoder (Western blot) og proteom eller lipidomic fremgangsmåder.
Protocol
Discussion
I modsætning til tidligere offentliggjorte fremgangsmåder, er denne protokol baseret på to trin, først til adskillelse af lette erhvervskøretøjer af en immuno-magnetisk metode, og det andet oprensningen af lette erhvervskøretøjer ved densitetsgradientcentrifugering. LCV isolation kan let følges ved hjælp af fluorescensmikroskopi, når enten fluorescensmærkede bakterier og GFP-producerende celler eller antistoffarvning anvendes. Protokollen beskrevet her er en simpel, ligetil fremgangsmåde, hvilket resu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i vores laboratorium blev støttet af Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians Universitet München, det tyske Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medicinske Infektion Genomics"-initiativet ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
