Rensing av Patogen vakuoler fra<em> Legionella</em>-Infiserte fagocytter
Summary
Denne artikkelen beskriver en metode for isolering og rensing av intakte<em> Legionella</em>-Holdige vakuoler (varebiler) fra amøbe og makrofager. De to-trinns-protokollen omfatter LCV anriking av immuno-magnetisk separasjon ved hjelp av et antistoff mot en bakteriell LCV markør og ytterligere rensing av tettshetsgradient sentrifugering.
Abstract
Den opportunistiske patogene Legionella pneumophila er en amøbe-resistente bakterien, som også replikerer i alveolære makrofager og dermed forårsaker alvorlig lungebetennelse "legionellose" en. I protozo og pattedyr fagocytter, L. pneumophila sysselsetter en konservert mekanisme for å danne en bestemt, replikering-ettergivende kupeen, den "Legionella-holdig vakuole" (LCV). LCV formasjon krever bakteriell icm / Dot type IV sekresjon system (T4SS), som translocates så mange som 275 "effektor" proteiner inn i vertsceller. De effektorer manipulere vertens proteiner samt lipider og kommunisere med sekretorisk, endosomal og mitokondrielle organeller 2-4.
Dannelsen av varebiler representerer en kompleks, robust og redundant prosess, noe som er vanskelig å fatte i en reduksjonistisk måte. En integrerende tilnærming er nødvendig for å grundig forstå LCV formasjon, inkludert en global analyse av banenogen-vert faktor interaksjoner og deres tidsmessige og romlig dynamikk. Som et første skritt mot dette målet, er intakt varebiler renset og analysert av proteomikk og lipidomics.
Sammensetningen og dannelse av patogen-holdige vakuoler er blitt etterforsket av proteomikk-analyse ved hjelp av væskekromatografi eller 2-D gel elektroforese koblet til masse-spektrometri. Vakuoler isolert fra enten sosiale jord amøbe Dictyostelium discoideum eller pattedyr fagocytter næret 5 Leishmania, Listeria 6, Mycobacterium 7, til rustfritt stål 8, Salmonella 9 eller Legionella spp.. Ti. Men rensing protokollene ansatt i disse studiene er tidkrevende og kjedelig, som de krever for eksempel elektronmikroskopi å analysere LCV morfologi, integritet og renhet. I tillegg gjør disse protokollene ikke utnytte spesifikke funksjoner i patogenet vakuole for norichment.
Metoden som presenteres her overvinner disse begrensningene ved å ansette D. discoideum produsere en fluorescerende LCV markør og ved å målrette den bakterielle effektor protein SidC, som selektivt anker til LCV membranen ved binding til phosphatidylinositol 4-fosfat (PtdIns (4) P) 3,11. Varebiler er beriket i et første steg for immuno-magnetisk separasjon ved hjelp av en affinitet-renset primær antistoff mot SidC og en sekundær antistoff koblet til magnetiske kuler, fulgte i det andre trinnet av en klassisk Histodenz tettshetsgradient sentrifugering 12,13 (Fig. 1) .
En proteomet studie av isolerte varebiler fra D. discoideum avdekket mer enn 560 vertscellen proteiner, inkludert proteiner assosiert med phagocytic vesikler, mitokondrier, ER og Golgi, samt flere GTPases, som ikke har vært innblandet i LCV formasjon før 13. Varebiler beriket og renset medprotokollen er skissert her kan bli ytterligere analysert ved mikroskopi (immunfluorescens, elektron mikroskopi), biokjemiske metoder (Western blot) og proteomikk eller lipidomic tilnærminger.
Protocol
Discussion
I motsetning til tidligere publiserte metoder, er denne protokollen basert på to trinn, først ved separasjon av varebiler med en immuno-magnetisk tilnærming, og andre, rensing av varebiler ved tettshetsgradient sentrifugering. Den LCV isolasjon kan lett følges av fluorescens mikroskopi, da enten fluorescensmerkede bakterier og GFP-produserende celler eller antistoff flekker brukes. Protokollen er beskrevet her er en enkel, rett-fram metoden, som resulterer i anriking av varebiler med høy renhet. Viktigere er protea…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i vårt laboratorium ble støttet av Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians Universitet i München, den tyske Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medisinske Infeksjon Genomics"-initiativet ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
