Rening av patogener vakuoler från<em> Legionella</em>-Infekterade Fagocyter
Summary
Denna artikel beskriver ett förfarande för isolering och rening av intakt<em> Legionella</em> Som innehåller vakuoler (lätta nyttofordon) från amöbor och makrofager. Den två-stegs protokoll innefattar lastfordonets anrikning av immuno-magnetisk separation med användning av en antikropp mot en bakteriell lastfordonets markör och ytterligare rening genom densitetsgradientcentrifugering.
Abstract
Den opportunistiska patogener Legionella pneumophila är en amöba-resistent bakterie, som också replikerar i alveolära makrofager vilket gör att svår lunginflammation "legionärssjukan" 1. I protozoiska och däggdjur fagocyter, L. pneumophila utnyttjar en konserverad mekanism för att bilda en specifik, replikationsdefekta tillåtande fack, den "Legionella-innehållande vakuolen" (LCV). Lastfordonets bildning kräver bakteriella ICM / Dot typ IV sekretionssystem (T4SS), som translokerar så många som 275 "effektor"-proteiner i värdceller. Effektorerna manipulera värdproteiner samt lipider och kommunicera med sekretoriska, endosomala och mitokondriell organeller 2-4.
Bildningen av lätta nyttofordon representerar en komplex, robust och redundanta process, som är svår att få grepp på en reduktionistiskt sätt. En integrerad strategi behövs för att fullständigt förstå LCV bildning, inklusive en global analys av vägenogen-värd faktor interaktioner och deras temporala och spatiala dynamik. Som ett första steg mot detta mål är intakta lätta nyttofordon renas och analyseras av proteomik och lipidomics.
Kompositionen och bildning av patogen-innehållande vakuoler har undersökts av proteomikanalys användning av vätskekromatografi eller 2-D gelelektroföres kopplad till masspektrometri. Vakuoler isolerade från antingen den sociala jorden amöban Dictyostelium discoideum eller däggdjur fagocyter hyste Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, Salmonella 9 eller Legionella spp. 10. De reningsprotokoll användes i dessa studier är tidskrävande och omständlig, eftersom de kräver t.ex. elektronmikroskop för att analysera LCV morfologi, integritet och renhet. Dessutom inte utnyttjar dessa protokoll inte särdrag patogenen vakuolen För ENrichment.
Metoden som presenteras här övervinner dessa begränsningar genom att använda D. discoideum producera en fluorescerande markör lastfordonets och genom att rikta den bakteriella effektorprotein SidC, som selektivt förankra till lastfordonets membranet genom bindning till fosfatidylinositol 4-fosfat (PtdIns (4) P) 3,11. Lätta nyttofordon är anrikade i ett första steg genom immuno-magnetisk separation med användning av en affinitets-renad primär antikropp mot SidC och en sekundär antikropp kopplad till magnetiska pärlor, följt i ett andra steg genom en klassisk Histodenz densitetsgradientcentrifugering 12,13 (fig. 1) .
En proteomanalys studie av isolerade lätta nyttofordon från D. discoideum visade mer än 560 värdcellproteiner, inklusive proteiner i samband med fagocytiska blåsor, mitokondrier, ER och Golgi, liksom flera GTPases, som inte varit inblandade i LCV formation före den 13. Lätta nyttofordon berikad och renades medprotokoll som beskrivs här kan vidare analyseras med mikroskopi (immunofluorescens, elektronmikroskopi), biokemiska metoder (Western blot) och proteomik eller lipidomic metoder.
Protocol
Discussion
I motsats till tidigare publicerade metoder, är detta protokoll baserat på två steg, först genom en uppdelning av lätta nyttofordon med en immuno-magnetiska tillvägagångssättet, och den andra, rening av lätta nyttofordon genom densitetsgradientcentrifugering. Lastfordonets isolering kan enkelt följas genom fluorescensmikroskopi, när antingen fluorescensmärkta bakterier och GFP-producerande celler eller antikroppsfärgning används. Det protokoll som beskrivits här är en enkel, okomplicerad metod, som resul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i vårt labb stöddes av Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians Universitetet München, tyska Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) och Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medical Infektion Genomics" initiativ ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
