نحن تصف طريقة تنميط لإنتاج المجهر coverslips المغلفة مع الجيلاتين الفلورسنت لتصور invadopodia بوساطة تدهور المصفوفة. وتعرض التقنيات الحاسوبية باستخدام البرمجيات المتاحة لقياس مستويات الناتجة من التحلل البروتيني مصفوفة واحدة من قبل خلايا داخل المختلط والسكان للمجموعات متعددة الخلايا المجهرية التي تشمل حقول بأكملها.
غزو الأنسجة الخلوية في المحلية هو عملية مهمة في التنمية والتوازن. Malregulated الغزو وما تلاه من حركة الخلايا هو سمة من العمليات المرضية متعددة، بما في ذلك الالتهاب، أمراض القلب والشرايين والأورام الانبثاث الخلية 1. مبؤرة تدهور بروتين من مكونات خارج الخلية (ECM) مصفوفة في الغشاء القاعدي الظهارية أو البطانية هو خطوة حاسمة في بدء الغزو الخلوية. في الخلايا السرطانية، قررت واسعة في تحليل المختبر أن يتم إنجاز ECM من تدهور الهياكل الغشائية البطنية الأكتين الغنية تبارزي وصف invadopodia 2،3. Invadopodia النموذج في بدل بالقرب من ECM، حيث معتدلة ECM انهيار من خلال عمل مصفوفة metalloproteinases (MMPs). قدرة الخلايا السرطانية على تشكيل invadopodia يرتبط بشكل مباشر مع القدرة على غزو سدى في الأوعية الدموية والمكونات المحلية المرتبطة بها 3.
_content "برزت> التصور من تدهور ECM invadopodia بوساطة الخلايا بواسطة المجهر الفلورسنت باستخدام مصفوفة البروتينات صبغ المسمى المغلفة coverslips على الزجاج والأسلوب الأكثر انتشارا لتقييم درجة التحلل البروتيني مصفوفة الخلوية وإمكانات الغازية 4،5. نحن هنا وصف يتم تحجيم بسهولة نسخة من الطريقة القياسية لتوليد coverslips الزجاج fluorescently التي تحمل علامات الاستفادة من ولاية أوريغون الخضراء المتاحة تجاريا-488 المتقارن الجيلاتين. هذه الطريقة لإنتاج بسرعة أعداد كبيرة من coverslips المغلفة. نعرض بعض من القطع الأثرية والمجهرية الشائعة التي غالبا ما واجهت يمكن خلال هذا الإجراء، وكيف يمكن تجنب هذه. وأخيرا، نحن تصف أساليب موحدة متاحة بسهولة باستخدام برامج الكمبيوتر للسماح الكمي للتدهور صفت مصفوفة الجيلاتين بوساطة الخلايا الفردية والسكان الخلوية بأكملها. والإجراءات المذكورة توفير القدرة على رصد دقيق وبتكاثر invadopodiaالنشاط، ويمكن أيضا أن تكون بمثابة منصة لتقييم فعالية بروتين تعبير تحوير أو اختبار المضادة للمركبات الغازية على تدهور المصفوفة خارج الخلية في أماكن متعددة الخلايا واحدة و.ساعد القدرة على تصور خلايا المصفوفة خارج الخلية المهينة في اكتشاف الآليات الجزيئية المستخدمة في الخطوات الأولى من الغزو الخلية. رائدها ون تيان تشين، في 4،14،15 اوائل عام 1980، برزت البروتينات خارج الخلية طلاء fluorescently المسمى على coverslips الزجاج للتحليل المجهري لاحق ك?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل الصناديق الوقفية من جامعة وست فرجينيا بوب ماري راندولف مركز السرطان. نشكر Susette مولر (جامعة جورج تاون) وكيلي لورا في وقت مبكر للحصول على المشورة والمساعدة. ومن المسلم به بامتنان استخدام مرفق جامعة فيرجينيا الغربية التصوير المجهري (بدعم من مركز السرطان بوب ماري راندولف و، NIH منح P20 RR16440، وRR032138 P30 P30 GM103488).
Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
sucrose | Fisher | BP220 | |
12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
NIS Elements software | Nikon |