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Biology

定量测量的侵袭伪足介导的细胞外基质蛋白水解单和多细胞的情况下

doi: 10.3791/4119 Published: August 27, 2012

Summary

我们描述了典型的方法涂有荧光可视化侵袭伪足介导的基质降解明胶的生产显微镜的盖玻片。利用现有的软件的计算技术,提出了一个混合的人口和量化结果由单个细胞内的基质蛋白水解为多细胞群体,涵盖整个微观领域。

Abstract

局部组织的细胞浸润到是一个重要的发展和平衡的过程。 malregulated入侵并随后细胞运动是多个病理过程,包括炎症,心血管疾病和肿瘤细胞转移1的特征。 focalized蛋白水解降解的胞外基质(ECM)的组件中的上皮细胞或内皮基底膜是启动细胞侵袭的一个关键步骤。在肿瘤细胞中,已确定, 在体外分析广泛ECM的降解是通过腹侧肌动蛋白富集膜凸结构称为侵袭伪足2,3。侵袭伪足形式在紧密合到的ECM,在那里它们通过的作用,基质金属蛋白酶(MMPs)中度ECM击穿。肿瘤细胞的能力,以形成侵袭伪足直接相关与标注侵入本地基质和相关的血管成分3。

_content“>可视化的侵袭伪足介导的细胞外基质降解的细胞荧光显微镜用染料标记的基质蛋白涂在玻片上已经成为最流行 ​​的技术评估基质蛋白水解的程度和细胞侵袭能力4,5。在这里,我们描述一个版本产生荧光标记的玻片上,利用商业可用的俄勒冈绿-488明胶共轭的标准方法,这种方法很容易扩展到迅速产生大量的涂盖玻片,我们中经常遇到的一些常见的微观文物在此过程中,如何将这些可避免的。最后,我们使用现成的电脑软件,允许标记的明胶基质的降解介导的单个细胞和整个细胞群的量化描述的标准化方法。所描述的程序提供了准确和可重复的监测能力侵袭伪足活性,也可以作为一个平台,用于评估调制蛋白的表达或测试抗侵入性的胞外基质降解的化合物对单和多细胞设置的疗效。

Protocol

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1。俄勒冈州绿色生产488-明胶涂层盖玻片

  1. 准备一个未标记的5%(w / w的)库存明胶/蔗糖溶液加入1.25克明胶和1.25克蔗糖在PBS中至终体积为50ml。的股票明胶溶液预热至37°C,并确保它完全融化之前使用。最终混合物在4℃下存放
  2. 清洁直径为13mm的第1玻璃盖玻片放置到24孔塑料组织培养板的各孔中的一个单独的盖玻片。向每孔中加入500μl的20%硝酸中,并温育30分钟。吸液的硝酸溶液,并用去离子水洗涤盖玻片三次。
  3. 用500μl的50微克/毫升多聚-L-赖氨酸(来自0.1%的原液制备,并用去离子水稀释的)到每个孔中,在室温下的20分钟的外套盖玻片。吸取溶液并用PBS洗三次。聚-L-赖氨酸涂层有利于均匀的涂层和粘接的上覆器1a贝莱德明胶。
  4. 向每孔中加入500μl的0.5%戊二醛溶液(使用前新鲜),孵育15分钟,在冰上的24孔培养板。吸,用冷PBS洗三次。明胶涂层之前,请务必删除所有的痕迹PBS。将板置于冰上,在所有的清洗,直到被添加明胶。
  5. 重构俄勒冈绿488-共轭明胶作为按照生产商的协议和温暖和未标记的5%明胶/蔗糖溶液(1.1)至37°C稀释的一部分俄勒冈绿488明胶分为八个部分的未标记的明胶/蔗糖( ,将500μl俄勒冈绿488明胶入4毫升5%明胶混合物)。移液管加入100μl稀释的488-明胶混合物(保持在37℃下)到每个盖玻片,使用足够的明胶涂布盖玻片无需手动,扩频(这会导致不均匀的盖玻片涂层,如在图3B中所示)。重要的是要保持在37稀释的488-明胶混合物°; C,在涂布程序,以防止过早凝固。从盖玻片这一步应保持在黑暗中尽可能地避免潜在的光漂白。其他ECM蛋白共轭的不同的荧光团,,俄勒冈绿488明胶(见讨论),可以被取代的。
  6. 一旦所有的盖玻片涂覆在一个单一的板,保持在24孔板在一个角度,然后从每个孔中通过真空抽吸除去过量的明胶。孵育10分钟,在室温下在黑暗中的涂布盖玻片。
  7. 盖玻片洗净3次,用PBS,然后加入500微升新鲜配制的5毫克/毫升的硼氢化钠(加入NaBH 4)在室温下15分钟,以减少和灭活剩余的戊二醛。硼氢化钠是泡腾片,每个盖玻片上和周围的小气泡将是显而易见的。
  8. 卸下NaBH 4溶液通过真空吸入周围以外的各孔中与一个快速扫动。请注意,不要拿起任何的浮动的盖玻片,成为脱离组织培养板底部的氢化钠治疗过程中。浮到顶部的独立盖玻片,轻轻地向后推到井底,但必须小心,以避免损坏蛋白质涂层。用PBS清洗各孔中的3倍,然后在70%乙醇中,在室温下的30分钟的孵育盖玻片。
  9. 使用无菌技术,传输盖玻片含一个IIA / B型细胞培养层流罩板的,用无菌PBS冲洗盖玻片3次。此时盖玻片可以被存储在至少两个月的PBS在4℃下避光。
  10. 传输用于退化检测到一个空孔的一个新的24孔板,使用无菌针和镊子小心去除盖玻片。平衡盖玻片为1-24小时,适合于特定的细胞类型,被检测的完整的媒体。必须小心不反转盖玻片或刮伤明胶涂层(参见图3B)。

2。电镀处理的细胞在俄勒冈绿488-明胶涂层法测定ECM降解的盖玻片

  1. 种子3-5×10 4细胞的盖玻片上,在24孔板的各孔的内。
  2. 进行一个时间过程的研究,以确定所需的侵袭伪足的降解活性的利益为特定的细胞系/类型的最佳时间。最侵入细胞需要4-24Ĥ降解的之间的时间变得显而易见,虽然这个范围可以很宽的范围内变化,应该凭经验确定。要同步侵袭伪足的活性,细胞可以与基质金属蛋白酶抑制剂( 例如 ,转基因6001)为所希望的时间周期内被处理,然后洗出的抑制剂,以允许侵袭伪足活动继续进行(例如,参见图6)。
  3. 冲洗的盖玻片三次用PBS,然后修复细胞用500μl的10%福尔马林缓冲液中的磷杂特15分钟。用PBS冲洗三次,和透性为4分钟,用0.​​4%的Triton X-100的PBS中。用PBS冲洗3次,以除去的Triton X-100。
  4. 标记细胞使用任何标准的协议进行免疫荧光染色(见7为例)荧光标记的鬼笔环肽的共同标记细胞与肌动蛋白丝(F-actin)的可视化,并为一个已知的标记蛋白定位于侵袭伪足(例如,皮层蛋白5,太古城第五期8,或N-WASP 9)。记住要避免使用488-标记的二次抗体或GFP-标记的蛋白质,如果使用俄勒冈绿488或FITC-标记的明胶,以防止信号干扰。
  5. 仔细反相盖玻片,并把它下降的ProLong Gold抗淬灭或类似的试剂染色显微镜载玻片盖玻片上安装。
  6. 为了评估基质的降解,在适当的渠道,使用传统的荧光共聚焦显微镜图像细胞。明胶降解是可视化作为由于荧光明胶( 图4A)的蛋白水解去除盖玻片上的暗区。肌动蛋白和侵袭伪足标记蛋白的细胞的标记允许用于确认在合并后的图像( 图4A)在网站的基质降解的侵袭伪足。
  7. 降解活性,也可实时监测活细胞成像与荧光标记的重组蛋白跟踪侵袭伪足的形成和基质降解5,10,11。

3。测量归一化矩阵退化荧光明胶退化的定量分析

该分析提供的归一化面积的区域的细胞或细胞的数量相对于基质的降解。它是有用的分析整个微观领域的多个单元格目前已集中处理的siRNA,或生长因子治疗药物。对于这个analysi,采集图像的低倍率是足以有效地收集信息有关的细胞群体。

  1. 打开的图像ImageJ的12。 ImageJ的,可以从http://www.macbiophotonics.ca/imagej/为镜。
  2. 检查秤通过选择菜单命令“ 分析/设置规模。该信息将自动导入多种文件格式的信息,但如果需要的话,可以手动输入。报告微米,而不是像素的测量是必要的适当的比例。
  3. 选择“ 分析/测量,选择适当的测量跟踪”。检查限制阈值
  4. 计算使用明胶的荧光图像( 图5A)的退化的区域。
  5. 阈值设置的上部和下部圆周率的图像(“ 图像/调整/阈值 ”)XEL强度值选择的区域以红色突出显示的退化( 图5B)。在随后的图像,使用“ 设置 ”按钮,在“阈值”窗口中的所有图像设置相同的阈值,作为一种客观选择降级区。
  6. 盖玻片在某些情况下,可能无法完全平坦的图像时获取。这会导致明胶改变整个图像的强度。如果这种变化产生的问题时,阈值的图像,整个明胶正确的照度不均匀减去背景(“ 进程/减背景”),或用带通滤波器滤波(“ 过程/ FFT /带通滤波器的 ”)或伪平场过滤器(“进程/滤镜/伪平场”),直到背景强度是一致的。
  7. 测量基质降解(“ 分析/分析颗粒 ”)的区域。在分析颗粒窗口中,选择粒径> 0来消除噪声从t他的选择。显示轮廓以确定地区的利益(投资回报率)。检查显示的结果总结 ,以显示测量结果。如果图中有明确概述了所有领域的降解( 图5C),复制到电子表格中的总面积测量。如果其他对象(如碎片),只记录领域相关的投资回报率。
  8. 计算使用鬼笔环肽染色(F-肌动蛋白)图像( 图5D)的小区区域。
  9. 阈值的图像(“ 图像/调整/阈值 ”)来设置的上部和下部的像素强度值,以使选择的细胞的边缘(以红色突出显示; 图5E)。在随后的图像,使用“ 设置 ”按钮,在“阈值”窗口中的所有图像设置相同的阈值作为目标选择单元面积。
  10. 10测量的区域的细胞(“ 分析/分析颗粒 ”)。在分析班驳CLES窗口中,选择粒径> 0来消除噪声的选择。显示轮廓 ,以确定区域进行分析( 图5F)。检查显示的结果总结,显示面积测量。不要检查包括孔,如果集群中的细胞之间有空格,所以非选定的像素,将不包括在群集内的单元面积计算。选择“确定”。
  11. 区域复制到电子表格中有关投资回报率。
  12. 计算明胶降解每个总面积的细胞13的面积。
  13. 的另一种方法将是每数量的细胞计数,细胞核( 图5G)报告的区域的退化。这是必要的,如果操纵改变不同的比较治疗组之间的小区区域。自动计数最好的,如果原子核很好的分离,均匀,强度和圆形。自动计算形核(“ 插件/粒子/核计数器分析 ”)。选择最小和最大粒径阈值法平滑方法 。检查中减去背景,流域过滤,添加粒子的投资回报率管理器 “和” 显示摘要图5H)。
  14. 如果核重叠广泛或有不规则的形状或纹理,自动计数可能无法准确计数( 图5H,右箭头)。在这种情况下,手动计数可以方便使用细胞计数器工具(“ 插件/粒子分析/细胞计数器 ”)。这将保持计数细胞标记在手动计数( 图5I)。
  15. 复制到电子表格中的细胞数(核)。计算每个总数细胞明胶降解的区域。

4。混合细胞群体中单个细胞的荧光明胶降解的定量为了评估在一个群体中,除了其他细胞内的字段( 例如 ,与非转染的细胞相比,转染的)的特定的细胞产生的基质降解,在第3条中的程序可以进行修改,以测量单个单元格的区域下的劣化。需要一个额外的荧光信道标记转染细胞。在这种情况下,更高的放大倍率的图像和分隔细胞更容易定量。

  1. 通过选择菜单命令“ 分析/设置规模。”选择“ 分析/测量,选择适当的测量跟踪检查秤的信息。”检查限制阈值
  2. 对于单个细胞没有接触,确定每个单元使用的F-肌动蛋白( 图6A)。 阈值 (见3.9)( 图6B)。重要的是要捕获的细胞的边​​缘,但可以有孔里面,不包括在阈值的。使用相同的强度值在图像上选择单元格的边界。
  3. 要测量区域的细胞,使用“分析/ 分析颗粒。”在分析颗粒窗口中,选择一个大小> 0(消除噪音),显示轮廓,并检查显示结果,添加到管理器包括孔 (记录在整个区域内的轮廓)。选择“ 确定”并记录“结果”窗口中的每个单元格的区域。
  4. 确定哪些细胞转染( 图6C)。
  5. 确定退化的区域,使用明胶的荧光图像( 图6D)。如果需要的话,过滤明胶的图像,甚至背景强度(见3.6)。 阈值选择方面的退化,使阈值设置的注意( 图6E)。在随后的图像,使用这些相同的上部和下部的强度值( 使用 Set在“阈值”窗口中的按钮)退化的地区的目标选择。
  6. 测量细胞的区域下的劣化。荧光明胶图像的阈值,表明细胞的轮廓,选择投资回报率的投资回报率管理器“窗口中,选择测量图6F)。记录结果并计算的归一化面积退化/细胞或细胞区。

5。代表性的成果

的步骤,在图1中所示的总体示意。该程序需要准备玻璃盖玻片和涂料的荧光标记的明胶,电镀涂层的盖玻片上的细胞,使细胞的明胶降解,修复和标记的细胞荧光显微分析,成像荧光矩阵来评估矩阵的完整性,客观量化的程度明胶基质的降解利用计算机仿真软件E。

图1
总体示意图如图1所示。荧光明胶涂层,细胞接种在突出的关键步骤,修复和免疫标记,并评估基质蛋白水解。

在制备和涂层玻璃盖玻片所涉及的主要过程步骤在图2中概述。

图2
图2示意图展示了涉及的各个步骤,准备以明胶为基涂层的玻璃盖玻片。在光(点亮灯泡),冰(立方体),并在黑暗中(非照明灯泡)进行的步骤是卡通表示。黑暗帮助中进行的步骤,防止漂白的荧光矩阵。

正确执行时,盖玻片均匀地涂上俄勒冈绿488-共轭克elatin时,可视化,显示均匀的荧光显微镜( 图3A)。典型的工件,可以引起不当的涂层,处理,贮存和使用涂层盖玻片如图3B中所示。

图3
图3。工件的过程中遇到的明胶涂层的玻片制备和处理。共焦的Z-Stack A.正交视图显示了典型的颜色和一致性的俄勒冈绿488-共轭明胶 ​​涂层盖玻片使用指定的协议。盖玻片应该有一个均匀的涂层,约1-2微米厚的( 底部 )在XZ和YZ( )共聚焦平面所示。B.工件,可以发生在明胶包被的盖玻片的涂布和处理包括:覆盖不当盖玻片在涂覆过程中由于混合不良,手动扩散或部分凝固的明胶混合物( 不均匀的涂层 ),除去涂覆矩阵的得分与在处理过程中( )的针或镊子,干燥的盖玻片表面在长时间的贮存期间,导致在一个“鹅卵石“外观( 脱水 ​​)和光漂白的荧光明胶表面在成像过程中,由于长时间或高强度的光照射(漂白)。白色箭头指示漂白的时间内,围绕一个的镀OSC19头和颈部鳞癌细胞。俄勒冈州的绿488-共轭明胶pseudocolored白色的增强图像的对比度。酒吧,10微米。

在此过程中产生的薄矩阵提供了一个敏感的方法来评估细胞的能力,降低ECM。 图4显示了一个例子侵袭伪足的活动,从OSC19细胞接种于俄勒冈绿-488共轭明胶 ​​盖玻片并通过常规的共聚焦显微镜的成像,以及由三维反卷积后的体积填充图像渲染。

图4
图4。侵袭伪足矩阵分解活性的代表性例子 invadopodia和相应的明胶基质蛋白水解的可视化。 OSC19镀上俄勒冈绿488共轭明胶盖玻片10小时的细胞被固定和标记的罗丹明共轭鬼笔环肽(F-肌动蛋白)和反皮层蛋白抗体(可视化的一个的Alexa Fluor 647二次抗体和pseudocolored绿色)。侵袭伪足为重点细胞质浓度的F-肌动蛋白和皮层蛋白的重叠区域内的:明胶结算(矩阵中的黑洞)合并后的图像是显而易见的。盒装区域含有箭头表明局灶性矩阵蛋白水解的个别invadopodia和区域所示,在扩大后的重新gions以下。酒吧,10微米。B。体积填充可视化侵袭伪足渗透到ECM。 OSC19镀和染色的细胞(A)中的用肉眼呈现通过获得23光学Z片连续0.32微米,共计7.04微米罗丹明共轭鬼笔环肽和俄勒冈绿488共轭明胶。本机LSM为每个通道设置的文件被打开了AutoQuant X2.2软件和一个3D的盲解卷积每个图像堆栈使用推荐的设置(10次迭代,中等噪音)。处理后的图像保存为TIFF栈,然后打开NIS元素,呈现为一个卷视图的alpha混合。 LUTS的进行了调整,并创建一个子卷到细胞内的侵袭伪足是目前显示的边缘。背边视图演示侵袭伪足(红色,箭头)插入底层明胶(绿色)。腹边缘“视图显示的前伸invadopodia和地区的明胶降解下面的盖玻片红色的的绿色矩阵(箭头)目前在的区域。整体形象领域的裁切为77×65微米的单元格是60 x 40微米。

图5示出了一些量化的归一化的明胶基质降解的重要步骤,在步骤3中所描述的协议。此过程被设计为允许的中立定量明胶退化的整个视场中,并且适合基质降解归因于许多细胞内的字段。

图5
图5。屏幕捕捉的图像,演示协议的第3步中的关键步骤,在整个显微图像在计算辅助量化的标准化的明胶降解的细胞。所有的荧光图像转换为灰度图像,以更好地显示红色的阈值和投资回报率(ROI)标记。A.我年龄俄勒冈绿488-共轭明胶 ​​,呈现出退化情况已发生的暗区(“洞”)(步骤3.4)。B.阈值以红色突出退化的地区(3.5)的明胶图像。C.图的ROI测量面积(步骤3.7)。退化。D.罗丹明鬼笔环肽染色的F-肌动蛋白(步骤3.8)。E.阈值肌动蛋白细胞总面积为红色(3.9)形象突出。F.图小区进行测量(步骤3.10) DAPI染色的细胞核。G.图片(3.13)。H.红色概述显示从自动核计算(3.13)的结果。的流域滤波器具有潜在的一个单独的原子核接触(白色箭头)。如果核重叠广泛,他们可能不会被分离成单独的对象(红色箭头)。如果一个核具有不规则的形状,它可以分离成多个对象(黄色箭头) 一</ STRONG>在手动计数细胞计数工具(3.14)标记细胞核的结果。

图6。演示了定量荧光明胶降解协议第4步中的单个细胞内的混合细胞群体中选择步骤。在这里,由转染的细胞的基质降解可以分析对转染的和未转染的细胞内的混合的人口。

图6
图6。屏幕捕捉图像的量化明胶降解从个人转染细胞内的细胞群所涉及的步骤。作为示例示出一个单一的转染OSC19细胞过表达重组皮层蛋白融合FLAG表位标记的定量。所有的荧光图像转换为灰度图像,以更好地显示红色的阈值和黄色的投资回报率瑕疵。A. (4.2)。图F-肌动蛋白染色的细胞总面积的基础上,应用阈值和C.共聚焦显微镜图像分析粒子功能(4.2-3)。展示一个单细胞表达FLAG标记的皮层蛋白(标有*)(步骤4.4)。D.俄勒冈绿488共轭明胶 ​​的图像,示出的暗区(“孔”)退化情况有上述细胞群的抗-FLAG免疫标记(4.5)发生E.阈值以红色突出暗区退化(4.5)的明胶图像。F.阈值化的明胶图像叠加与B组(4.6)的细胞轮廓。需要注意的是阈值的像素都算在细胞内的轮廓分析。地区以外的电流的单元格位置(白箭头)的结果,随着时间的推移从细胞迁移横跨明胶降解和不包含内建于分析。

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Discussion

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辅助能力,可视化细胞降解细胞外基质中发现的早期步骤侵袭细胞的分子机制。陈文添在20世纪80年代初4,14,15首创,涂料荧光标记的细胞外蛋白质随后的微观分析的盖玻片上已经出现的主要技术评估侵袭伪足的功能范围广泛的细胞类型。规定的协议演示的基本的方法,用于制备明胶包被的盖玻片,形成一个小于2微米厚的胶原层适合于检测到的细胞外基质降解由细胞中最常规的荧光和激光共聚焦显微镜11,16-18,类似于拥有什么先前已经描述19-21。这些属性允许快速生产能够检测基质降解的发病的最初涂层盖玻片。日所提供的敏感度Ë导致明胶基质薄底层的硬质玻璃表面可能有助于促进侵袭伪足的形成响应的高固有刚度的整体矩阵环境22。然而,这些矩阵没有得到很好的适合于分析侵袭伪足的伸长或额外的形态评价方面已取得使用较厚的(30-100微米)的明胶层相似的方法,涂覆的Transwell小室内或电子显微镜20,23,24。

我们已经发现,商业化生产的预共轭俄勒冈绿488明胶允许快速实验设置和一致的,可重复的结果。然而,碱性硼酸盐结合异硫氰酸荧光素(FITC)未标记的明胶仍然是一个流行和便宜的方法生产荧光明胶的结合物20。作为一种替代的基质蛋白标签和盖玻片涂层4,9,和在某些情况下也可用于纤维粘连蛋白vestigators使用标记的未标记的明胶涂层盖玻片上创建更密集的矩阵11,25层纤维连接蛋白。其他矩阵可以被使用,这取决于细胞类型的具体。在除了染料在绿色的488nm的频谱中,也得到了广泛的荧光用手动的偶联方法来生成盖玻片与不同的荧光光谱,包括罗丹明21,26,的Alexa Fluor 350 24,546 21,568 5,11 594 27 647 5染料。容易适应这样的结合物是用于在规定的协议,提供用于利用特定的细胞外基质蛋白 - 染料组合,适用于大多数任何成像筛选器集的灵活性。

本文描述的技术公布之前提供必要的用于利用ImageJ的量化归因于单个细胞的明胶基质降解在异构人口或整个单元组的详细步骤iously 6,28。专有软件也被成功地用于同样的目的5,25。在这个协议中,基质降解的区域被归一化到的总面积的细胞或细胞的总数(核),在该领域。一般来说,这两个选项正常化将给出相同的结果(ELW,数据未示出)。但是,如果具有不同大小的细胞不同的细胞系,被比较或如果实验处理使细胞改变大小,那么它可能是更准确正常化细胞数。在另一方面,许多肿瘤细胞株有高百分比的多核细胞,在这种情况下,总的小区区域可能是一个更准确的参数正常化。此外,如果只有一个单元的一部分被捕获的图像( 图6)中,它可能是更好的正常化小区区域,而不是低估的单个单元格的退化潜力。重要的是要优化的图像分析,以最适合的具体实验装置的特点和细微差别。

用于确定在一个拥挤的领域中的细胞数目,计数细胞核往往是给出的方法。 ImageJ的有核计数器自动计数插件。在此工具中的一个选项是流域的过滤器。该过滤器将帮助独立的核接触,分离成单个对象( 图5H,白箭头)。然而,该过滤器可能无法分开细胞核广泛重叠( 图5H,红色箭头)。此外,如果一个核具有不规则的形状和强度的大的变化,过滤器可能会分离出单核到多个对象( 图5H,黄色箭头)。因此,重要的是要尝试不同的阈值和平滑在此插件的方法进行分析,以确定最佳的参数。如果自动计数不准确的数字,细胞计数插件可以FACI litate手工计数的细胞或细胞核。

利用瞬时转染的情况下,图像会经常包含的混合物的细胞表达或不表达感兴趣的( 图6)中的蛋白质。在这种情况下,它并不总是明显细胞负责创建基质降解的领域。如果细胞迁移横跨明胶,这是特别真实的。在分析中是一致的,它是重要的是只测量退化区域的正下方各小区。通过阈值选择在矩阵中的暗区和使用的肌动蛋白的产生细胞的轮廓,只有下的细胞的退化地区将定量。此过程将排除降级区外的单元格边界分析( 图6F,箭头)。分析可能需要进行优化选择的时间点,允许有足够的时间降解的细胞前,有机会移动。

除了基质降解,经常报道的其他参数包括:确定每个细胞侵袭伪足的数目,显示侵袭伪足内一个给定的人口的细胞的百分比,和的数目“未成熟”>许多方法已被开发,以定量侵袭伪足的形成和功能。 “或”前“相比,”成熟“侵袭伪足能降解的ECM 11,13,25,26的非降解的侵袭伪足(s)的侵袭伪足评价选择的方法取决于固有的特性的不同的细胞类型。比如,计算每个细胞的侵袭伪足确定包含侵袭伪足的细胞的百分比是一个很简单的方法,效果很好,如果所分析的细胞只包含几个突出的侵袭伪足,但侵袭伪足或有几十个,侵袭伪足可小细胞变得更加困难和难以察觉。使用退化测定使得能够计算预侵袭伪足v百分比第成熟的侵袭伪足在单细胞或在一个群体中,通过比较侵袭伪足细胞总数的百分比降解矩阵。如果有较少的细胞有辱人格的矩阵显示侵袭伪足的细胞相比,有差异,这可能表明,这些细胞形成前的侵袭伪足的时间固定细胞,基质降解能力。

不管选择方法相结合进行分析,它是重要的量化所需的侵袭伪足特性尽可能客观。显微镜上采集图像时,选择字段在细胞(肌动蛋白),而不是荧光基质,通过查找从优先选择的退化水平高的地方,以避免偏见。应获得的多幅图像,以确保公平代表性的细胞群。图像也应在适当的放大倍率收购。对于均匀的细胞群体,低倍率可以使用以收集更多的细胞,只要还是可以解决的退化的区域。高放大倍率的图像是首选的测量区域内单个细胞和解决个别侵袭伪足。当区域被定量,基于强度的阈值的图像是比手动选择的区域的矩阵来衡量更客观。在所有情况下,应足够数量的细胞从多个独立实验分析,以得到在统计上有意义的,可重现的结果。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是从西弗吉尼亚大学玛丽巴布伦道夫癌症中心捐赠基金的支持。我们感谢“穆勒Susette(乔治城大学)和劳拉·凯利早期的意见和协助。西弗吉尼亚大学的显微成像设备的使用(支持玛丽巴布兰多夫癌症中心,国立卫生研究院资助P20 RR16440,P30 RR032138和P30 GM103488)表​​示感谢。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gelatin Sigma G1890 Porcine skin
sucrose Fisher BP220
12 mm coverslips Fisher 50-121-5159
24 well plates Fisher 08-772-1 BD Falcon
nitric acid Ricca R5326000 20% solution
poly-L-lysine Electron Microscopy Sciences 19320-B 0.1% solution
glutaraldehyde Sigma G7526 8% solution
Oregon Green 488-conjugated gelatin Invitrogen G-13186
sodium borohydride Sigma 213462
Triton X-100 Fisher BP151
rhodamine-phalloidin Invitrogen R415
anti-cortactin (clone 4F11) Millipore 05-180
Anti-FLAG antibody Millipore MAB3118
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A21235
ProLong Gold antifade Invitrogen P36930
LSM 510 Confocal Microscope Zeiss
ImageJ software Public domain http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
AutoQuant X2.2 software Media Cybernetics
NIS Elements software Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
  2. Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
  3. Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. (2010).
  4. Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
  5. Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
  6. Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. (2008).
  7. Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
  8. Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
  9. Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
  10. Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
  11. Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
  12. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, (7), 36-42 (2004).
  13. Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
  14. Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
  15. Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
  16. Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
  17. Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317, (10), 195-209 (2011).
  18. Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
  19. Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
  20. Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
  21. Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
  22. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  23. Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
  24. Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
  25. Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
  26. Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
  27. Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
  28. Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. (2010).
定量测量的侵袭伪足介导的细胞外基质蛋白水解单和多细胞的情况下
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Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts . J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).More

Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts . J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).

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