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Biology

एकल और multicellular संदर्भों में invadopodia मध्यस्थता कोशिकी मैट्रिक्स proteolysis के मात्रात्मक मापन

doi: 10.3791/4119 Published: August 27, 2012

Summary

हम खुर्दबीन invadopodia की मध्यस्थता मैट्रिक्स गिरावट visualizing के लिए फ्लोरोसेंट जेलाटीन के साथ लेपित coverslips के उत्पादन के लिए prototypical विधि का वर्णन है. कम्प्यूटेशनल उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग तकनीक एक मिश्रित आबादी के भीतर और multicellular पूरे सूक्ष्म क्षेत्रों को शामिल समूहों के लिए एकल कक्षों के द्वारा मैट्रिक्स proteolysis के परिणामस्वरूप स्तर बढ़ाता के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं.

Abstract

स्थानीय ऊतकों में सेलुलर आक्रमण विकास और homeostasis में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है. Malregulated आक्रमण और बाद में सेल आंदोलन सूजन, हृदय रोग और ट्यूमर सेल 1 मेटास्टेसिस सहित कई रोग प्रक्रियाओं की विशेषता है. उपकला या endothelial तहखाने झिल्ली में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों के Focalized proteolytic गिरावट सेलुलर आक्रमण की शुरुआत में एक महत्वपूर्ण कदम है. ट्यूमर कोशिकाओं में, इन विट्रो विश्लेषण में व्यापक निर्धारित किया है कि ईसीएम गिरावट उदर actin अमीर झिल्ली उत्क्षेपणशील 2,3 invadopodia करार दिया संरचनाओं के द्वारा पूरा किया है. ईसीएम, जहां वे मैट्रिक्स metalloproteinases (एमएमपी) की कार्रवाई के माध्यम से उदारवादी ECM टूटने के करीब समानाधिकरण में invadopodia फार्म. ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता को invadopodia फार्म सीधे स्थानीय stroma और संबद्ध संवहनी उपकरणों 3 में आक्रमण करने की क्षमता के साथ संबद्ध है.

> invadopodia की मध्यस्थता फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं डाई लेबल मैट्रिक्स कांच coverslips पर लेपित प्रोटीन का उपयोग ECM गिरावट के विज़ुअलाइज़ेशन _content "मैट्रिक्स proteolysis और सेलुलर आक्रामक क्षमता 4,5 की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए सबसे अधिक प्रचलित तकनीक के रूप में उभरा है, यहाँ हम का वर्णन है. fluorescently लेबल कांच coverslips का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ओरेगन ग्रीन 488 जिलेटिन संयुग्म पैदा करने के लिए मानक विधि का एक संस्करण इस विधि आसानी से तेजी से लेपित coverslips की बड़ी संख्या का उत्पादन बढ़ाया है. हम आम सूक्ष्म कलाकृतियों कि अक्सर सामना कर रहे हैं की कुछ दिखाने इस प्रक्रिया के दौरान और कैसे इन. बचा जा सकता है अंत में, हम मानकीकृत आसानी से उपलब्ध कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए लेबल जेलाटीन मैट्रिक्स व्यक्ति की कोशिकाओं और पूरे सेलुलर आबादी द्वारा मध्यस्थता गिरावट की मात्रा का ठहराव की अनुमति विधियों का वर्णन करती है. वर्णित प्रक्रियाओं सही और reproducibly की निगरानी करने की क्षमता प्रदान करते हैं invadopodiaगतिविधि है, और भी प्रोटीन अभिव्यक्ति modulating या एकल और multicellular सेटिंग में बाह्य मैट्रिक्स गिरावट पर विरोधी इनवेसिव यौगिकों के परीक्षण की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं.

Protocol

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1. ओरेगन ग्रीन के उत्पादन 488 जेलाटीन लेपित Coverslips

  1. 1.25 छ जिलेटिन और पीबीएस में 1.25 ग्राम 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा sucrose जोड़कर एक unlabeled 5% (w / w) स्टॉक जिलेटिन / sucrose समाधान तैयार. शेयर 37 डिग्री सेल्सियस जिलेटिन समाधान गर्म और यह सुनिश्चित करने का उपयोग करने से पहले पूरी तरह से पिघल रहा है. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम मिश्रण स्टोर
  2. एक 24 अच्छी तरह से प्लास्टिक टिशू कल्चर की थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से एक व्यक्ति coverslip रखने के द्वारा 13 मिमी व्यास # 1 गिलास coverslips साफ. एक अच्छी तरह से करने के लिए 20% की नाइट्रिक एसिड के 500 μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए सेते हैं. नाइट्रिक एसिड समाधान Aspirate और coverslips विआयनीकृत पानी के साथ तीन बार धो.
  3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 50 ग्राम / पाली एल lysine मिलीलीटर (0.1% शेयर समाधान से तैयार है और विआयनीकृत पानी में पतला) के 500 μl के साथ एक अच्छी तरह से कोट coverslips. समाधान Aspirate और पीबीएस के साथ तीन बार धो लो. पाली - एल Lysine कोटिंग भी और overlying ला के कोटिंग संबंध की सुविधाजिलेटिन beled.
  4. एक अच्छी तरह से करने के लिए 0.5% glutaraldehyde के 500 μl जोड़ें (का उपयोग करने से पहले ताजा) बनाया और 24 में 15 मिनट के लिए बर्फ पर अच्छी तरह प्लेटें सेते हैं. Aspirate और ठंड पीबीएस के साथ तीन बार धो लो. पीबीएस के सभी निशान जेलाटीन कोटिंग से पहले दूर करने के लिए सुनिश्चित. बर्फ पर प्लेटें सभी washes के दौरान रखें जब तक जिलेटिन जोड़ा जाता है.
  5. ओरेगन 488 संयुग्मित ग्रीन प्रोटोकॉल के अनुसार निर्माता और यह गर्म और unlabeled 5% जिलैटिन / sucrose समाधान से (1.1) के रूप में 37 डिग्री सेल्सियस जेलाटीन reconstitute Unlabeled जेलाटीन sucrose / (5% जिलैटिन मिश्रण के 4 मिलीलीटर में ओरेगन ग्रीन 488 जिलेटिन की 500 μl यानी) के आठ भागों में एक हिस्सा ओरेगन ग्रीन 488 जिलेटिन पतला. Pipet प्रत्येक coverslip पर पतला मिश्रण 488 जेलाटीन (37 डिग्री सेल्सियस पर रखा) के 100 μl, पर्याप्त पुस्तिका फैल (जो असमान coverslip कोटिंग करने के लिए नेतृत्व के रूप में 3B चित्र में दिखाया जा सकता है) के बिना coverslip कोट जिलेटिन का उपयोग. यह महत्वपूर्ण है कि 37 में पतला मिश्रण 488 जेलाटीन रखने °कोटिंग करने के लिए समय से पहले solidification को रोकने की प्रक्रिया के दौरान सी. इस कदम से आगे coverslips जितना संभव हो के लिए संभावित photobleaching से बचने के अंधेरे में रखा जाना चाहिए. अन्य ECM विभिन्न fluorophores संयुग्मित प्रोटीन ओरेगन ग्रीन 488 जिलेटिन (चर्चा देखने के लिए) के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
  6. एक बार सभी coverslips एक ही थाली में लेपित हैं, एक कोण पर 24 अच्छी तरह से थाली पकड़ और वैक्यूम आकांक्षा से प्रत्येक में अच्छी तरह से हटाने के अतिरिक्त जेलाटीन. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में लेपित coverslips सेते हैं.
  7. Coverslips पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, तो ताजा बना 5 मिलीग्राम / एमएल कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कम और अवशिष्ट glutaraldehyde निष्क्रिय करने के लिए सोडियम borohydride (4 NaBH) के 500 μl जोड़ें. सोडियम borohydride चमकता हुआ है, और छोटे बुलबुले पर और चारों ओर प्रत्येक coverslip स्पष्ट हो जाएगा.
  8. वैक्यूम आकांक्षा द्वारा एक अच्छी तरह से बाहर चारों ओर एक त्वरित व्यापक प्रस्ताव के साथ NaBH 4 समाधान निकालें. नहीं ख्याल रखना किसी भी चल coverslips कि टिशू कल्चर प्लेट के नीचे से अलग हो गया NaBH 4 उपचार के दौरान लेने. असम्बद्ध coverslips कि ऊपर फ्लोट करने धीरे से पीछे धकेल दिया सकता है नीचे अच्छी तरह से नीचे करने के लिए, लेकिन देखभाल करने के लिए प्रोटीन कोटिंग हानिकारक से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से तीन बार धोएं और फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में coverslips सेते हैं.
  9. बाँझ तकनीक का उपयोग करते हुए, एक प्रकार सेल / आईआईए बी संस्कृति लामिना का प्रवाह हुड coverslip युक्त प्लेटों हस्तांतरण और coverslips बाँझ पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला. इस बिंदु पर coverslips 4 पर प्रकाश से संरक्षित पीबीएस डिग्री सेल्सियस में कम से कम दो महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है.
  10. Coverslips स्थानांतरण गिरावट assays के लिए सावधान एक बाँझ सुई और संदंश का उपयोग हटाने के द्वारा एक नया 24 अच्छी तरह से थाली के एक खाली अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा. Coverslips पूरा विशेष सेल प्रकार assayed किया जा रहा करने के लिए उपयुक्त मीडिया के साथ 1-24 घंटे के लिए संतुलन में लाना. ध्यान रखा जाना चाहिए नहीं होना चाहिएcoverslip पलटना या जेलाटीन कोटिंग खरोंच (चित्रा 3B देखें).

2. और ओरेगन ग्रीन पर कक्षों के प्रसंस्करण चढ़ाना 488 जेलाटीन परख ईसीएम गिरावट लेपित Coverslips

  1. बीज 3-5x10 4 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह के भीतर एक coverslip पर कोशिकाओं.
  2. एक समय पाठ्यक्रम अध्ययन का संचालन करने के लिए इष्टतम invadopodia गिरावट गतिविधि के लिए विशेष सेल लाइन / ब्याज के प्रकार के लिए आवश्यक समय का निर्धारण करने के लिए. सबसे आक्रामक कोशिकाओं गिरावट के लिए 4-24 घंटे के बीच एक समय स्पष्ट हो, हालांकि इस रेंज में व्यापक रूप से भिन्न है और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए कर सकते हैं की आवश्यकता होती है. Invadopodia गतिविधि सिंक्रनाइज़, कोशिकाओं को एक इच्छित समय अवधि के लिए एमएमपी inhibitors (उदाहरण के लिए, 6001 जीएम) के साथ इलाज किया जा सकता है, तो बाहर अवरोध करनेवाला धोने के लिए invadopodia गतिविधि को आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं (उदाहरण के लिए, 6 देखें).
  3. Coverslips पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला, तो 10% की 500 μl के साथ कोशिकाओं को ठीक formalin phospha buffered15 मिनट के लिए ते. पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला और 0.4% ट्राइटन साथ 4 मिनट पीबीएस में X-100 के लिए permeabilize. हटा X-100 ट्राइटन पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला.
  4. 5 cortactin, TKS5, सह लेबलिंग कोशिकाओं द्वारा लेबल फ्लोरोसेंट संयुग्मित phalloidin साथ immunofluorescence धुंधला के लिए किसी भी मानक प्रोटोकॉल (7 उदाहरण के लिए देखें) actin filaments (F-actin) कल्पना और एक ज्ञात मार्कर प्रोटीन है कि invadopodia लिए localizes के लिए (जैसे की कोशिकाओं का उपयोग 8 या 9 एन ततैया) 488 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी या GFP लेबल प्रोटीन का उपयोग अगर ओरेगन 488 ग्रीन या संकेत हस्तक्षेप को रोकने के लिए जेलाटीन FITC लेबल का उपयोग कर से बचने के लिए याद रखें.
  5. ध्यान inverting coverslip द्वारा कांच खुर्दबीन स्लाइड पर दाग coverslips माउंट और गोल्ड antifade या इसी तरह अभिकर्मक लम्बा की एक बूंद पर रखकर.
  6. एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट या confocal खुर्दबीन का उपयोग उचित चैनलों में मैट्रिक्स गिरावट, छवि कोशिकाओं का आकलन करने के लिए. जिलेटिन गिरावटफ्लोरोसेंट जिलेटिन की proteolytic हटाने (4A चित्रा) के कारण coverslip पर गहरा क्षेत्रों के रूप में देखे. Actin और एक invadopodia मार्कर प्रोटीन कोशिकाओं की लेबलिंग invadopodia मैट्रिक्स गिरावट के मर्ज किए गए छवियों में साइटों (4A चित्रा) पर पुष्टि के लिए अनुमति देता है.
  7. ह्रास गतिविधि भी फ्लोरोसेंट टैग पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ जीना सेल इमेजिंग invadopodia गठन और मैट्रिक्स गिरावट 5,10,11 ट्रैक से वास्तविक समय में नजर रखी जा सकती है.

3. प्रतिदीप्त जिलेटिन गिरावट की सामान्यीकृत मैट्रिक्स गिरावट मापने द्वारा मात्रा का ठहराव

इस विश्लेषण मैट्रिक्स गिरावट की सामान्यीकृत क्षेत्र कोशिकाओं का क्षेत्र या कोशिकाओं की संख्या के सापेक्ष प्रदान करता है. यह देखने के पूरे सूक्ष्म क्षेत्रों जहां कई मौजूद कोशिकाओं सामूहिक रूप से किया गया है कि siRNA, वृद्धि कारक या चिकित्सीय एजेंट के साथ व्यवहार कर रहे हैं का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है. इस विश्लेषण के लिए, छवियों कम बढ़ाई एकत्र कुशलता से कोशिकाओं की आबादी के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त हैं.

  1. 12 ImageJ में छवियों को खोलें. माइक्रोस्कोपी के लिए ImageJ से डाउनलोड किया जा सकता है http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
  2. मेनू आदेश का चयन / विश्लेषण पैमाने पर सेट. "यह जानकारी स्वचालित रूप से कई फ़ाइल स्वरूपों के साथ आयात करेगा पैमाने पर जानकारी की जाँच करें, लेकिन मैन्युअल रूप से प्रवेश किया जा सकता है, यदि आवश्यक. उचित स्केलिंग पिक्सेल के बजाय microns में माप की रिपोर्ट करने के लिए आवश्यक है.
  3. चुनने के द्वारा उचित माप करने के लिए ट्रैक का चयन करें "माप / विश्लेषण सेट." क्षेत्र की जांच और थ्रेसहोल्ड सीमा.
  4. फ्लोरोसेंट जेलाटीन छवि (चित्रा 5A) का उपयोग गिरावट के क्षेत्र की गणना.
  5. सीमा छवि ("छवि / / समायोजित थ्रेसहोल्ड") ऊपरी और निचले बगुलाभगत स्थापित करने के लिएXEL तीव्रता मूल्यों गिरावट के क्षेत्रों (, चित्रा 5B लाल रंग में हाइलाइट) का चयन करने के लिए. बाद में छवियों में, थ्रेसहोल्ड खिड़की में सेट बटन का उपयोग करने के लिए सभी छवियों के लिए एक ही सीमा निर्धारित रूप में एक उद्देश्य गिरावट के क्षेत्र का चयन करने का मतलब है.
  6. कुछ मामलों में, coverslip पूरी तरह से फ्लैट नहीं हो सकता है जब छवियों का अधिग्रहण कर रहे हैं हो सकता है. इस छवि के पार परिवर्तन जिलेटिन की तीव्रता का कारण बनता है. यदि यह बदलाव समस्याएं पैदा करता है जब छवि, पृष्ठभूमि subtracting द्वारा जेलाटीन भर में असमान रोशनी के लिए सही ("प्रक्रिया / पृष्ठभूमि घटाएं") या एक bandpass फिल्टर के साथ फ़िल्टर करके ("प्रक्रिया / FFT / bandpass फिल्टर") या एक छद्म flatfield थ्रेशोल्डिंग फिल्टर ("/ प्रक्रिया फिल्टर / Flatfield छद्म") पृष्ठभूमि तीव्रता तक एक समान है.
  7. मैट्रिक्स गिरावट (कण विश्लेषण / विश्लेषण ") के क्षेत्र मापें. विश्लेषण कण खिड़की में, एक कण आकार> 0 का चयन करने के लिए टी से शोर हटानेवह चयन. शो के लिए हित के क्षेत्रों (ROIs) की पहचान करने के लिए रूपरेखा. प्रदर्शन के परिणामों की जांच और माप चलता संक्षेप में प्रस्तुत करना. अगर ड्राइंग गिरावट के क्षेत्रों (चित्रा 5C) के विशेष रूप से रेखांकित किया है, एक स्प्रेडशीट में कुल क्षेत्रफल माप की नकल. यदि अन्य वस्तुओं (जैसे मलबे के रूप में) का चयन किया गया था, केवल प्रासंगिक ROIs के क्षेत्रों रिकॉर्ड.
  8. सेल phalloidin (F-actin) दाग छवि (चित्रा 5D) का उपयोग कर क्षेत्र की गणना.
  9. थ्रेसहोल्ड ("छवि / समायोजित / थ्रेसहोल्ड") छवि के ऊपरी और निचले पिक्सेल तीव्रता मूल्यों इतना है कि कोशिकाओं के किनारों का चयन कर रहे हैं (लाल रंग में प्रकाश डाला, चित्रा 5E) सेट. बाद में छवियों में, थ्रेसहोल्ड खिड़की में सेट बटन का उपयोग करने के लिए सभी छवियों के लिए एक ही सीमा निर्धारित एक उद्देश्य के रूप में सेल क्षेत्र का चयन करने का मतलब है.
  10. 10 उपाय कोशिकाओं के क्षेत्र ("विश्लेषण / कण विश्लेषण"). विश्लेषण गड्डcles खिड़की, एक कण आकार> 0 चुनने के लिए चयन से शोर हटाने. शो के लिए विश्लेषण (चित्रा 5F) के लिए क्षेत्रों की पहचान करने के लिए रूपरेखा. प्रदर्शन के परिणामों की जांच के लिए और क्षेत्र मापन दिखाने संक्षेप में प्रस्तुत करना. मत जांचें छेद शामिल अगर वहाँ एक क्लस्टर में कोशिकाओं के बीच रिक्त स्थान हैं तो क्लस्टर के भीतर गैर चयनित पिक्सल सेल क्षेत्र गणना में शामिल नहीं किया जाएगा. ठीक चुनें.
  11. एक स्प्रेडशीट में प्रासंगिक ROIs के लिए क्षेत्र के परिणामों की प्रतिलिपि.
  12. 13 कोशिकाओं के कुल क्षेत्र के प्रति जेलाटीन गिरावट के क्षेत्र की गणना.
  13. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण नाभिक (चित्रा 5G) की गिनती से कोशिकाओं की संख्या के अनुसार गिरावट के क्षेत्र की रिपोर्ट करने के लिए होगा. अगर जोड़तोड़ अलग तुलना में उपचार समूहों के बीच सेल क्षेत्र में परिवर्तन के लिए यह आवश्यक है. स्वचालित गिनती का सबसे अच्छा काम करता है, अगर अच्छी तरह से नाभिक, अलग तीव्रता और दौर में वर्दी. स्वचालित रूप से Nucle गिनतीमैं ("/ Plugins कण / विश्लेषण न्यूक्लियस काउंटर"). सबसे छोटा और सबसे बड़ा कण आकार, एक सीमा विधि और एक चौरसाई विधि चुनें. जांच पृष्ठभूमि, वाटरशेड फ़िल्टर घटाना, आरओआई प्रबंधक और दिखाएँ सारांश (5H चित्रा) कणों जोड़ें.
  14. यदि नाभिक बड़े पैमाने पर ओवरलैप या एक अनियमित आकार या बनावट है, स्वत: गिनती एक सटीक गणना (5H चित्रा, सही पर तीर) का उत्पादन नहीं हो सकता है. इस मामले में, मैनुअल गिनती सेल काउंटर उपकरण का उपयोग ("/ Plugins कण विश्लेषण / सेल काउंटर) की जा सकती है. यह गिनती रखने के रूप में कोशिकाओं को एक पुस्तिका गिनती (5i चित्रा) के दौरान के रूप में चिह्नित कर रहे हैं.
  15. एक स्प्रेडशीट में कोशिकाओं की संख्या (नाभिक) कॉपी. कोशिकाओं की कुल संख्या प्रति जेलाटीन गिरावट के क्षेत्र की गणना.

4. व्यक्ति की कोशिकाओं द्वारा प्रतिदीप्त जिलेटिन गिरावट का एक मिश्रित सेलुलर जनसंख्या में मात्रा का ठहराव मैट्रिक्स एक अलग क्षेत्र के भीतर अन्य कोशिकाओं (जैसे, बनाम गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट) से जनसंख्या में विशिष्ट कोशिकाओं से उत्पन्न गिरावट का मूल्यांकन करने के लिए, 3 अनुभाग में प्रक्रिया व्यक्ति की कोशिकाओं के तहत गिरावट के क्षेत्र को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है. एक अतिरिक्त फ्लोरोसेंट चैनल ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को चिह्नित करने की जरूरत है. इस उदाहरण में, उच्च वृद्धि के चित्र और अच्छी तरह से अलग कोशिकाओं आसान quantitate करने के लिए कर रहे हैं.

  1. मेनू आदेश का चयन / विश्लेषण पैमाने पर सेट. "चुनकर चुनें उपयुक्त ट्रैक करने के लिए माप के द्वारा बड़े पैमाने पर जानकारी की जाँच करें" माप / विश्लेषण सेट. " क्षेत्र की जांच और थ्रेसहोल्ड सीमा.
  2. व्यक्तिगत कोशिकाओं है कि नहीं छू रहे हैं के लिए, प्रत्येक F-actin छवि (6A चित्रा) का उपयोग सेल थ्रेसहोल्ड (3.9 देखें) छवि (चित्रा 6B) की पहचान. कोशिकाओं के किनारों पर कब्जा करने के लिए यह महत्वपूर्ण है, लेकिन वहाँ छेद हो सकता हैकि अंदर सीमा में शामिल नहीं हैं. छवियों भर में एक ही तीव्रता मूल्यों का उपयोग सेल सीमाओं का चयन करने के लिए.
  3. कोशिकाओं के क्षेत्र को मापने के लिए, का उपयोग करें "विश्लेषण / कण विश्लेषण." विश्लेषण कण खिड़की में, एक आकार> 0 (शोर को समाप्त करने के लिए), दिखाएँ रूपरेखा चुनते हैं, और प्रदर्शन परिणाम की जांच, प्रबंधक को जोड़ें और छेद (रिकॉर्ड रूपरेखा के अंदर पूरे क्षेत्र). ठीक चुनें और परिणाम विंडो से प्रत्येक कक्ष के लिए क्षेत्र रिकॉर्ड.
  4. कोशिकाओं जो (6C चित्रा) ट्रांसफ़ेक्ट पहचानें.
  5. गिरावट के क्षेत्रों फ्लोरोसेंट जेलाटीन छवि (6D चित्रा) के प्रयोग को पहचानें. यदि आवश्यक हो, तो जेलाटीन छवि पृष्ठभूमि तीव्रता (3.6 देखें) भी फिल्टर थ्रेसहोल्ड. गिरावट के क्षेत्रों का चयन, सीमा सेटिंग्स (6E चित्रा) नोट बनाने. बाद छवियों पर, ये वही ऊपरी और निचले तीव्रता (मान का उपयोग कर सेट का उपयोग करेंगिरावट के क्षेत्रों में से एक उद्देश्य के चयन के लिए दहलीज विंडो में बटन).
  6. कोशिकाओं के तहत गिरावट के क्षेत्रों उपाय. Thresholded फ्लोरोसेंट जेलाटीन छवि, आरओआई प्रबंधक विंडो में ROIs चयन और उपाय (6F चित्रा) का चयन करके कक्षों की एक रूपरेखा दिखाने. परिणाम रिकॉर्ड और गिरावट / सेल या सेल क्षेत्र की सामान्यीकृत क्षेत्र की गणना.

5. प्रतिनिधि परिणाम

प्रक्रिया के लिए समग्र योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है. प्रक्रिया fluorescently संयुग्मित जिलेटिन के साथ कांच coverslips और कोटिंग की तैयारी की जरूरत पर जोर देता है, लेपित coverslips पर कोशिकाओं के चढ़ाना कोशिकाओं जेलाटीन नीचा करने के लिए अनुमति देते हैं, फिक्सिंग है और प्रतिदीप्ति सूक्ष्म विश्लेषण के लिए कक्षों की लेबलिंग, इमेजिंग मैट्रिक्स अखंडता का आकलन फ्लोरोसेंट मैट्रिक्स, और निष्पक्ष जेलाटीन मैट्रिक्स गिरावट की डिग्री का उपयोग कर कंप्यूटर softwar बढ़ाताई.

चित्रा 1
चित्रा 1 कुल मिलाकर कुंजी फ्लोरोसेंट जेलाटीन कोटिंग, सेल चढ़ाना में शामिल कदम पर प्रकाश डाला, फिक्सिंग और immunolabeling, और मैट्रिक्स proteolysis का मूल्यांकन योजनाबद्ध.

प्रमुख प्रक्रियात्मक तैयारी और कोटिंग कांच coverslips में शामिल कदम चित्रा 2 में उल्लिखित हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 व्यक्ति कांच coverslips जेलाटीन मैट्रिक्स कोटिंग के लिए तैयार करने में शामिल कदम प्रदर्शन योजनाबद्ध. (जलाया बल्ब) बर्फ (cubes) पर प्रकाश और अंधेरे (गैर - प्रबुद्ध बल्ब) में किए गए कदम हैं कार्टून संकेत दिया. अंधेरे मदद में आयोजित कदम फ्लोरोसेंट matrices के photobleaching रोकने के लिए.

जब ठीक से प्रदर्शन किया, coverslips ओरेगन छ 488 संयुग्मित ग्रीन के साथ समान रूप से कर रहे हैं लेपितelatin, समरूप प्रतिदीप्ति प्रदर्शित जब माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized (चित्रा 3). विशिष्ट कलाकृतियों कि अनुचित कोटिंग करने के लिए कारण पैदा कर सकते हैं, हैंडलिंग, भंडारण, और लेपित coverslips का उपयोग चित्रा 3B में दिखाए जाते हैं.

चित्रा 3
कलाकृतियों के उदाहरण चित्रा 3. जेलाटीन लेपित coverslip तैयारी और हैंडलिंग के दौरान सामना करना पड़ा एक confocal Z-ढेर के orthogonal दृश्य ठेठ रंग और स्थिरता एक ओरेगन ग्रीन के 488 संयुग्मित जेलाटीन लेपित coverslip निर्धारित प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पादन दिखा. एक समरूप कोटिंग Coverslips ~ 1-2 सुक्ष्ममापी मोटी के रूप में XZ (नीचे) और YZ (दाएं) confocal विमानों में दिखाया जाना चाहिए बी कलाकृतियों कि और जिलेटिन लेपित coverslips की कोटिंग प्रसंस्करण के दौरान हो सकता है में शामिल हैं: के अनुचित को कवर कोटिंग कारण प्रक्रिया के दौरान coverslipगरीब मिश्रण, जेलाटीन मिश्रण (असमान कोटिंग), लेपित मैट्रिक्स की हैंडलिंग (परिमार्जन) के दौरान या सुई संदंश के साथ स्कोरिंग, लंबे समय तक भंडारण अवधि के दौरान coverslip सतह के सूखने से हटाने, एक "cobblestone में जिसके परिणामस्वरूप के प्रसार मैनुअल या आंशिक solidification "(निर्जलित) उपस्थिति और लंबे समय तक या उच्च तीव्रता प्रकाश जोखिम (विरंजन) के कारण इमेजिंग दौरान फ्लोरोसेंट जेलाटीन सतह के photobleaching. व्हाइट तीर प्रक्षालित शामिल एक मढ़वाया OSC19 सिर और गर्दन के स्क्वैमस कार्सिनोमा सेल क्षेत्र इंगित करता है. ओरेगन ग्रीन 488 संयुग्मित जिलेटिन सफेद pseudocolored छवि के विपरीत बढ़ाने. बार, 10 सुक्ष्ममापी.

जिसके परिणामस्वरूप इस प्रक्रिया के दौरान उत्पादित पतली matrices एक संवेदनशील कोशिकाओं की क्षमता को ईसीएम नीचा का मूल्यांकन करने के लिए साधन उपलब्ध कराने के 4 चित्रा एक OSC19 एक ओरेगन ग्रीन 488 संयुग्मित जेलाटीन coverslip पर चढ़ाया सेल से invadopodia गतिविधि का एक उदाहरण यह दर्शाता है.और पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मात्रा भरने छवि प्रतिपादन के बाद तीन आयामी deconvolution द्वारा imaged.

चित्रा 4
चित्रा 4 invadopodia मैट्रिक्स गिरावट गतिविधि के प्रतिनिधि उदाहरण. Invadopodia और इसी जेलाटीन मैट्रिक्स proteolysis विज़ुअलाइज़ेशन. ओरेगन ग्रीन 10 के लिए 488 संयुग्मित जेलाटीन coverslips मढ़वाया OSC19 कोशिकाओं घंटा तय की और थे rhodamine संयुग्मित (F-actin) phalloidin और विरोधी cortactin एंटीबॉडी (एक Alexa Fluor 647 माध्यमिक एंटीबॉडी और pseudocolored हरे रंग के साथ देखे) के साथ लेबल. Invadopodia एफ actin और cortactin फोकल cytoplasmic सांद्रता कि मर्ज किए गए छवि के भीतर जिलेटिन समाशोधन (मैट्रिक्स में अंधेरे छेद) के क्षेत्रों के साथ ओवरलैप के रूप में स्पष्ट कर रहे हैं. बॉक्स्ड arrowheads युक्त क्षेत्रों व्यक्ति और फोकल मैट्रिक्स proteolysis के invadopodia क्षेत्रों से संकेत मिलता है के रूप में बढ़े हुए पुनः में दिखायानीचे gions. बार, 10 बी. सुक्ष्ममापी. वॉल्यूम ECM में invadopodia प्रवेश के दृश्य भरने के लिए. (ए) के रूप में चढ़ाया और दाग OSC19 कोशिकाओं नेत्रहीन 23 लगातार 0.32 z-स्लाइस ऑप्टिकल सुक्ष्ममापी rhodamine संयुग्मित phalloidin और ओरेगन ग्रीन जिलेटिन 488 संयुग्मित के लिए 7.04 सुक्ष्ममापी कुल प्राप्त करने के द्वारा गाया गया था. देशी LSM प्रत्येक चैनल के लिए सेट फ़ाइल AutoQuant X2.2 सॉफ्टवेयर में खोला गया था और प्रत्येक छवि के ढेर के एक 3D अंधा deconvolution सिफारिश की सेटिंग्स (10 पुनरावृत्तियों, मध्यम शोर) का उपयोग किया गया था. संसाधित छवियों कि तब एनआईएस तत्वों में खोला गया था और अल्फा सम्मिश्रण के साथ एक मात्रा देखने के रूप में प्रदान की झगड़ा ढेर के रूप में सहेजा गया. LUTs समायोजित कर रहे थे और एक subvolume सेल जहां invadopodia मौजूद हैं अंदर एक बढ़त दिखाने के लिए बनाया गया था. पृष्ठीय बढ़त देखने invadopodia (लाल, तीर) अंतर्निहित जिलेटिन (हरा) में डाला दर्शाता है. वेंट्रल बढ़त देखने उत्क्षेपणशील invadopodia और coverslip नीचे क्षेत्रों जिलैटिन गिरावट का पता चलता हैहरे रंग मैट्रिक्स (तीर) में मौजूद लाल के क्षेत्रों के रूप में. कुल छवि प्रस्तुत क्षेत्र 77 x 65 सुक्ष्ममापी फसली है, सेल ~ 60 x 40 सुक्ष्ममापी है.

चित्रा 5 सामान्यीकृत जेलाटीन मैट्रिक्स गिरावट की मात्रा का ठहराव के लिए महत्वपूर्ण कदम के रूप में प्रोटोकॉल के चरण 3 में वर्णित कुछ पता चलता है. इस प्रक्रिया को देखने के एक पूरे क्षेत्र में जेलाटीन गिरावट के निष्पक्ष quantitation के लिए अनुमति देने के लिए बनाया गया है, और मैट्रिक्स के क्षेत्र के भीतर कई कोशिकाओं को जिम्मेदार ठहराया गिरावट के लिए उपयुक्त है.

चित्रा 5
चित्रा 5 स्क्रीन पर कब्जा छवियों सामान्यीकृत जेलाटीन गिरावट की मात्रा का ठहराव कम्प्यूटेशनल की मदद से एक पूरी छवि के भीतर सूक्ष्म कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण कदम के प्रदर्शन के रूप में प्रोटोकॉल चरण 3 में वर्णित है. सभी फ्लोरोसेंट छवियों के लिए बेहतर लाल thresholding और ROI चिह्नों प्रदर्शित ग्रेस्केल बदल दिया गया है Im.ओरेगन 488 संयुग्मित जिलेटिन, अंधेरे क्षेत्रों ("छेद") जहां गिरावट हुई है ग्रीन की उम्र (3.4 कदम) बी. जेलाटीन छवि लाल (3.5 कदम) में गिरावट के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला Thresholded सी. आरेखण ROIs दिखा क्षेत्र के लिए मापा (3.7 कदम) गिरावट के एफ actin (3.8 कदम) के डी. rhodamine phalloidin धुंधला हो जाना. ई. actin लाल (3.9 कदम) में कुल सेल क्षेत्र पर प्रकाश डाला छवि Thresholded एफ आरेखण सेल क्षेत्रों दिखा मापा जा (3.10 कदम) DAPI दाग सेल नाभिक के जी छवि (3.13 कदम). एच. लाल स्वचालित नाभिक गिनती (3.13 कदम) से शो के परिणाम की रूपरेखा. वाटरशेड फिल्टर अलग नाभिक है कि छू रहे हैं (सफेद तीर) की क्षमता है. यदि नाभिक बड़े पैमाने पर ओवरलैप करते हैं, वे व्यक्तिगत वस्तुओं (लाल तीर) में अलग नहीं हो सकता है. यदि एक नाभिक एक अनियमित आकार है, यह कई वस्तुओं (पीले तीर) में विभाजित किया जा सकता है मैं. </ एक मैनुअल सेल काउंटर (3.14 कदम) उपकरण का उपयोग गिनती के दौरान नाभिक अंकन से मजबूत> परिणाम.

6 चित्रा. का चयन व्यक्ति की कोशिकाओं द्वारा एक मिश्रित सेलुलर आबादी के भीतर फ्लोरोसेंट जेलाटीन गिरावट के रूप में प्रोटोकॉल चरण 4 में वर्णित बढ़ाता में शामिल कदम दर्शाता है. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं द्वारा मैट्रिक्स गिरावट के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी के भीतर विश्लेषण किया जा सकता है.

चित्रा 6
चित्रा 6 स्क्रीन व्यक्तिगत ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से एक सेल आबादी के भीतर जेलाटीन गिरावट बढ़ाता में शामिल कदम की छवियों पर कब्जा. एक ट्रांसफ़ेक्ट OSC19 सेल overexpressing रीकॉम्बीनैंट झंडा मिलान टैग से इनकार cortactin की मात्रा एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है. सभी फ्लोरोसेंट छवियों के लिए बेहतर लाल thresholding और पीले ROI ज़्यादा से ज़्यादा चिह्नों प्रदर्शित ग्रेस्केल बदल दिया गया है ए. बी आरेखण थ्रेसहोल्ड के आवेदन के बाद और कण कार्यों (4.2-3 कदम) का विश्लेषण सी. Confocal छवि. सेल की आबादी का विरोधी झंडा immunolabeling एक एकल झंडा टैग cortactin (* से चिह्नित) (4.4 कदम) ओरेगन ग्रीन जिलेटिन 488 संयुग्मित की. डी. छवि व्यक्त सेल का प्रदर्शन, अंधेरे ("छेद") क्षेत्रों में जहां गिरावट है दिखा हुआ (4.5 कदम) ई. जेलाटीन छवि लाल रंग में गिरावट (4.5 कदम) के अंधेरे क्षेत्रों पर प्रकाश डाला Thresholded एफ. पैनल बी (4.6 कदम) से सेल रूपरेखा के साथ जेलाटीन छवि मढ़ा Thresholded. ध्यान दें कि केवल सेल रूपरेखा के भीतर thresholded पिक्सल के विश्लेषण में गिने जाते हैं. गिरावट के वर्तमान सेल (सफेद तीर) स्थान जेलाटीन भर में समय पर सेल प्रवास से परिणाम बाहर क्षेत्रों और inclu नहीं कर रहे हैंविश्लेषण में ded.

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Discussion

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कोशिकी मैट्रिक्स अपमानजनक कोशिकाओं कल्पना करने की क्षमता आणविक सेल आक्रमण के प्रारंभिक चरणों में कार्यरत तंत्र की खोज में सहायता प्राप्त है. 4,14,15 जल्दी है 1980 में वेन टीएन चेन ने बीड़ा उठाया है, बाद में सूक्ष्म विश्लेषण के लिए कांच coverslips पर कोटिंग fluorescently लेबल कोशिकी प्रोटीन सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला के पार invadopodia समारोह का मूल्यांकन करने में प्राथमिक तकनीक के रूप में उभरा है. निर्धारित प्रोटोकॉल मूल क्या है जिलेटिन लेपित coverslips है कि एक collagenous कम से कम 2 सुक्ष्ममापी मोटी परत फार्म सबसे पारंपरिक फ्लोरोसेंट और confocal 11,16-18 सूक्ष्मदर्शी में कोशिकाओं द्वारा बाह्य मैट्रिक्स गिरावट का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैं, इसी तरह की तैयारी करने के लिए इस्तेमाल किया विधि दर्शाता किया गया है पहले 19-21 में वर्णित है. इन गुणों लेपित मैट्रिक्स गिरावट की प्रारंभिक शुरुआत का पता लगाने में सक्षम coverslips के तेजी से उत्पादन के लिए अनुमति देते हैं. वें द्वारा afforded संवेदनशीलताई अंतर्निहित invadopodia गठन समग्र मैट्रिक्स 22 पर्यावरण की उच्च निहित कठोरता के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में बढ़ावा देने में हार्ड कांच की सतह की संभावना एड्स पर पतली जेलाटीन मैट्रिक्स के परिणामस्वरूप. हालांकि, इन matrices invadopodia बढ़ाव या अतिरिक्त रूपात्मक मूल्यांकन है कि मोटा (30-100 सुक्ष्ममापी) का उपयोग करते हुए समान पद्धति, लेपित transwells या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 20,23,24 के साथ जेलाटीन परतों हासिल किया गया है के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं कर रहे हैं.

हमने पाया है कि पूर्व संयुग्मित वाणिज्यिक उत्पादन ओरेगन ग्रीन 488 जिलेटिन तेजी प्रयोगात्मक सेट और संगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम के लिए अनुमति देता है. हालांकि, fluorescein unlabeled जिलेटिन आइसोथियोसाइनेट (FITC) के alkaline borate संयुग्मन फ्लोरोसेंट जेलाटीन conjugates 20 के उत्पादन के लिए एक लोकप्रिय और सस्ता तरीका रहता है. Fibronectin भी लेबलिंग और coverslip कोटिंग 4,9, के लिए एक वैकल्पिक मैट्रिक्स प्रोटीन के रूप में प्रयोग किया जाता है और कुछ मामलों मेंvestigators लेबल unlabeled जेलाटीन लेपित coverslips पर स्तरित denser matrices 11,25 बनाने के fibronectin इस्तेमाल किया है. अन्य matrices सेल प्रकार की बारीकियों के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. हरी 488 एनएम स्पेक्ट्रम में रंगों के अलावा, fluorophores की एक विस्तृत श्रृंखला भी मैनुअल युग्मन तरीकों के साथ प्रयोग किया गया है अलग प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा साथ 21,26 rhodamine Alexa Fluor 350 24, 546 21, 568 5,11 सहित coverslips उत्पन्न , 594, 27 और 647 5 रंजक. ऐसे conjugates निर्धारित प्रोटोकॉल में उपयोग करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय रहे हैं, विशिष्ट ECM प्रोटीन डाई सबसे अधिक किसी भी इमेजिंग फिल्टर सेट के लिए उपयुक्त संयोजन का उपयोग करने के लिए लचीलापन प्रदान करते हैं.

तकनीकों का वर्णन के साथ साथ आवश्यक ImageJ का उपयोग करने के लिए एक विषम जनसंख्या में या पूरे सेल समूहों जेलाटीन मैट्रिक्स व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया गिरावट यों के लिए विस्तृत कदम प्रदान करने के रूप में पिछला प्रकाशितiously 6,28. मालिकाना सॉफ्टवेयर भी दिया गया है सफलतापूर्वक ही 5,25 उद्देश्य के लिए कार्यरत हैं. इस प्रोटोकॉल में, मैट्रिक्स गिरावट के क्षेत्र में या तो कोशिकाओं के कुल क्षेत्र या क्षेत्र में कोशिकाओं की कुल संख्या (नाभिक) normalized है. आम तौर पर, सामान्य बनाने के लिए दोनों विकल्प एक ही परिणाम दे (ELW, नहीं दिखाया डेटा). हालांकि, अगर अलग सेल लाइनों अलग अलग आकार कोशिकाओं की तुलना में किया जा रहा है या अगर प्रयोगात्मक उपचार कोशिकाओं का कारण बनता है आकार बदलने के लिए, तो यह अधिक के लिए सेल नंबर के लिए मानक के अनुसार करने के लिए सही हो सकता है. दूसरी ओर, कई कैंसर कोशिका लाइनों बहु nucleated कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत है, जो मामले में कुल सेल क्षेत्र सामान्य बनाने के लिए एक और अधिक सटीक पैरामीटर हो सकता है. इसके अलावा, अगर एक सेल का ही हिस्सा एक छवि (चित्रा 6) में कब्जा कर लिया है, यह बेहतर होगा सेल क्षेत्र के लिए मानक के अनुसार के बजाय एक व्यक्ति के सेल के लिए गिरावट की क्षमता बहुत मूल्यवान समझना हो सकता है. यह महत्वपूर्ण है कि सबसे अच्छा सूट छवि विश्लेषण का अनुकूलनविशेषताओं और विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप की बारीकियों.

एक भीड़ भरे क्षेत्र में सेल नंबर को निर्धारित करने के लिए, नाभिक गिनती अक्सर पसंद की विधि है. ImageJ स्वत: गिनती के लिए एक नाभिक काउंटर प्लगइन है. इस उपकरण में एक विकल्प वाटरशेड फिल्टर है. इस फिल्टर अलग नाभिक कि उन्हें व्यक्तिगत वस्तुओं (चित्रा 5H, सफेद तीर) में segregating छू रहे हैं में मदद मिलेगी. हालांकि, इस फिल्टर अलग नाभिक है कि बड़े पैमाने पर ओवरलैप (5H चित्रा, लाल तीर) करने में सक्षम नहीं हो सकता. इसके अलावा, अगर एक नाभिक एक अनियमित आकार और तीव्रता में बड़े बदलाव है, फिल्टर कई वस्तुओं (चित्रा 5H, पीले तीर) में एक एकल नाभिक अलग कर सकते हैं. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है thresholding और चौरसाई इस प्लगइन में विभिन्न तरीकों की कोशिश करने के लिए विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा मापदंडों का निर्धारण. यदि स्वत: गिनती सही संख्या का उत्पादन नहीं करता है, सेल काउंटर प्लगइन faci कर सकते हैं कोशिकाओं या नाभिक के मैनुअल गिनती litate.

क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग मामलों में, छवियों अक्सर व्यक्त कोशिकाओं का एक मिश्रण होते हैं या ब्याज (6 चित्रा) के एक प्रोटीन व्यक्त नहीं. इस परिदृश्य में, यह हमेशा स्पष्ट नहीं है जो कोशिकाओं मैट्रिक्स गिरावट के क्षेत्रों बनाने के लिए जिम्मेदार थे. यह विशेष रूप से सच है अगर कोशिकाओं जेलाटीन भर में पलायन कर रहे हैं. विश्लेषण में लगातार हो सकता है, यह महत्वपूर्ण है कि केवल प्रत्येक कोशिका के नीचे सीधे अपमानित क्षेत्रों उपाय. मैट्रिक्स में अंधेरे क्षेत्रों का चयन करें और actin का उपयोग करने के लिए सेल की रूपरेखा उत्पन्न थ्रेशोल्डिंग, केवल कोशिकाओं के तहत अपमानित क्षेत्रों quantitated जाएगा. इस प्रक्रिया के विश्लेषण से सेल सीमाओं (चित्रा 6F तीर) के बाहर अपमानित क्षेत्रों को बाहर निकाल देगा. परख अनुकूलन की आवश्यकता के लिए एक समय का कहना है कि गिरावट के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है इससे पहले कि कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक मौका मिला है का चयन कर सकते हैं.

"> कई तरीके quantitate invadopodia गठन और समारोह के लिए विकसित किया गया है. मैट्रिक्स गिरावट के अलावा, अक्सर रिपोर्ट अन्य पैरामीटर सेल प्रति invadopodia की संख्या, एक दिया आबादी के भीतर invadopodia प्रदर्शित कोशिकाओं का प्रतिशत, और की संख्या का निर्धारण करने में शामिल हैं" अपरिपक्व पूर्व "या" परिपक्व "की अपमानजनक ईसीएम 11,13,25,26 सक्षम invadopodia" गैर अपमानजनक invadopodia की तुलना में "(ओं) invadopodia मूल्यांकन के लिए विधि पसंद की प्रत्येक कोशिका प्रकार के निहित विशेषताओं पर निर्भर. उदाहरण के लिए, सेल प्रति invadopodia की संख्या गिनती या invadopodia युक्त कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए एक स्पष्ट दृष्टिकोण है कि अच्छी तरह से काम करता है अगर विश्लेषण कोशिकाओं सिर्फ एक कुछ प्रमुख invadopodia होते है, लेकिन कोशिकाओं है है कि invadopodia के दर्जनों या जहां invadopodia छोटा हो सकता है में और अधिक मुश्किल हो जाता है और मुश्किल का पता लगाने गिरावट परख का प्रयोग पूर्व invadopodia वी के प्रतिशत की गणना करने के लिए यह संभव बनाता हैहै. कोशिकाओं में एकल या एक जनसंख्या में प्रतिशत कर रहे हैं कि अपमानजनक मैट्रिक्स invadopodia के साथ कोशिकाओं की कुल संख्या की तुलना परिपक्व invadopodia. अगर वहाँ एक विसंगति है जहां कम कोशिकाओं invadopodia प्रदर्शित करने कोशिकाओं की तुलना में अपमानजनक मैट्रिक्स है, यह संकेत हो सकता है कि इन कोशिकाओं को बना रहे हैं पूर्व invadopodia कि कोशिकाओं तय किया गया कि समय मैट्रिक्स गिरावट के काबिल थे.

जो विधि संयोजन विश्लेषण के लिए चुना जाता है, यह महत्वपूर्ण है कि वांछित invadopodia विशेषताओं के रूप में संभव के रूप में निष्पक्ष मात्रा ठहराना. जब खुर्दबीन पर एकत्रित (actin) फ्लोरोसेंट मैट्रिक्स बजाय, कोशिकाओं को देखने के लिए preferentially गिरावट के उच्च स्तर के साथ क्षेत्रों का चयन करने से पूर्वाग्रह से बचने के द्वारा क्षेत्रों का चयन. एकाधिक छवियों के लिए सेल की आबादी का एक उचित प्रतिनिधित्व सुनिश्चित करने के लिए हासिल किया जाना चाहिए. छवियाँ भी एक उपयुक्त बढ़ाई हासिल किया जाना चाहिए. कोशिकाओं के समान आबादी के लिए कर सकते हैं, कम बढ़ाईकरने के लिए लंबे समय के रूप में और अधिक गिरावट के क्षेत्रों के रूप में अभी भी हल किया जा सकता है कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया. उच्च वृद्धि के चित्र के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं के अधीन क्षेत्रों को मापने और व्यक्ति invadopodia को हल करने के लिए पसंद कर रहे हैं. जब क्षेत्रों quantitated जा रहे हैं, तीव्रता के आधार पर छवियों थ्रेशोल्डिंग स्वयं को मापने के मैट्रिक्स के क्षेत्र को चुनने से उद्देश्य है. सभी मामलों में, कई स्वतंत्र प्रयोगों से कोशिकाओं के एक पर्याप्त संख्या में सांख्यिकीय सार्थक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

बंदोबस्ती धन के द्वारा यह काम पश्चिम वर्जीनिया विश्वविद्यालय मैरी Babb Randolph कैंसर केंद्र से समर्थन किया था. हम जल्दी सलाह और सहायता के लिए Susette मुलर (जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय) और लौरा Kelley धन्यवाद. पश्चिम वर्जीनिया विश्वविद्यालय माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा का उपयोग करें (मैरी Babb Randolph कैंसर केंद्र और, एनआईएच P20 अनुदान RR16440, RR032138 P30 और GM103488 P30 द्वारा समर्थित) कृतज्ञता से स्वीकार किया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gelatin Sigma G1890 Porcine skin
sucrose Fisher BP220
12 mm coverslips Fisher 50-121-5159
24 well plates Fisher 08-772-1 BD Falcon
nitric acid Ricca R5326000 20% solution
poly-L-lysine Electron Microscopy Sciences 19320-B 0.1% solution
glutaraldehyde Sigma G7526 8% solution
Oregon Green 488-conjugated gelatin Invitrogen G-13186
sodium borohydride Sigma 213462
Triton X-100 Fisher BP151
rhodamine-phalloidin Invitrogen R415
anti-cortactin (clone 4F11) Millipore 05-180
Anti-FLAG antibody Millipore MAB3118
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A21235
ProLong Gold antifade Invitrogen P36930
LSM 510 Confocal Microscope Zeiss
ImageJ software Public domain http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
AutoQuant X2.2 software Media Cybernetics
NIS Elements software Nikon

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References

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एकल और multicellular संदर्भों में invadopodia मध्यस्थता कोशिकी मैट्रिक्स proteolysis के मात्रात्मक मापन
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Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts . J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).More

Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts . J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).

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