Мы описываем прототип способ получения микроскопом покровные покрыта флуоресцентной желатина для визуализации invadopodia-опосредованной деградации матрице. Вычислительные методы с использованием доступного программного обеспечения представлены для количественного определения результирующего уровня матрицы протеолиза одной клетки в смешанной популяции и для многоклеточных группы охватывает весь микроскопических полей.
Сотовый вторжения в местных тканей является важным процессом в развитии и гомеостаза. Malregulated вторжения и последующего движения клетки характерно несколько патологических процессов, в том числе воспаление, сердечно-сосудистые заболевания и метастазов опухолевых клеток 1. Сосредоточен деградации протеолитическими внеклеточного матрикса (ECM) компонентов в эпителиальной или эндотелиальной базальной мембраны является важным шагом в налаживании сотовой вторжения. В опухолевых клетках, обширный анализ в лабораторных установила, что ECM деградации осуществляется вентральной актина богатых мембранных структур называют выступающими invadopodia 2,3. Invadopodia форме в тесном прикладывание к ECM, где они отвечают ECM пробоя под действием матриксных металлопротеиназ (ММП). Способность опухолевых клеток с образованием invadopodia прямо коррелирует со способностью вторгаться в местные стромы и связанные с ними сосудистые компоненты 3.
_content "> Визуализация invadopodia ECM-опосредованной деградации клеток с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием красителей-меченых белков матрицы наносится на стекло покровные стала наиболее распространенной техникой для оценки степени протеолиза матрицы и сотовые инвазивный потенциал 4,5. Здесь мы опишем версия стандартный метод генерации флуоресцентно-меченных покровные стекла с использованием коммерчески доступных Орегон Зеленый-488 желатином сопряжены. этот метод легко масштабируется быстро производить большое количество покрытием покровные. Покажем некоторые общие микроскопические артефакты, которые часто встречаются Во время этой процедуры и как их можно избежать. Наконец, мы опишем стандартные методы использования доступны компьютерные программы, чтобы количественное меченых желатин деградации матрицы опосредовано отдельных клеток и целых клеточных популяций. описанные процедуры дают возможность точно и воспроизводимо мониторинг invadopodiaдеятельности, а также может служить в качестве платформы для оценки эффективности модуляции экспрессии белка или тестирование по борьбе с инвазивными соединений на деградацию внеклеточных матриц в одно-и многоклеточных настройки.Способность визуализировать клетки унижающие внеклеточного матрикса помог в раскрытии молекулярных механизмов, занятых в ранних стадиях клеточного вторжения. Pioneered Вэнь-тянь Chen в начале 1980-х годов 4,14,15, покрытием флуоресцентно меченых белков внеклеточного на стекло покровные д…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана благотворительные фонды из Университета Западной Вирджинии Мария Babb Randolph онкологический центр. Мы благодарим Susette Мюллер (Georgetown University) и Лора Келли для ранней консультации и помощь. Использование West Virginia University фонда изображений микроскопии (при поддержке Марии Babb Randolph онкологический центр и, NIH гранты RR16440 P20, P30 и P30 RR032138 GM103488) с благодарностью.
Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
sucrose | Fisher | BP220 | |
12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
NIS Elements software | Nikon |