Summary
मजबूत, छोटे पैमाने पर HeLa परमाणु अर्क की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. यह प्रोटोकॉल assays कि दवाओं या आरएनएआई के साथ इलाज किया कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं की छोटी आबादी, के उपयोग की आवश्यकता के लिए बहुमूल्य है. विधि जीन अभिव्यक्ति assays और रोगी कोशिकाओं सहित अन्य प्रकार सेल, की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू होना चाहिए.
Abstract
समझ जीन अभिव्यक्ति में प्रगति का एक बड़ा सौदा इन विट्रो प्रणालियों में उपयोग किया गया है. सबसे अध्ययन के लिए, कार्यात्मक assays के निष्कर्षों की है कि थोक में निलंबन में विकसित कोशिकाओं की 10-50 या उससे अधिक लीटर से तैयार कर रहे हैं का उपयोग किया जाता है. हालांकि, इन बड़े पैमाने पर तैयारी तेजी से परीक्षण करने के लिए उत्तरदायी इन विट्रो प्रभाव में नहीं हैं कि परिणाम में vivo सेलुलर उपचार या स्थितियों में की एक किस्म से. यह पत्रिका वीडियो लेख कार्यात्मक छोटे पैमाने पर परमाणु अर्क की तैयारी, एक उदाहरण के रूप में HELA कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक विधि से पता चलता है. इस विधि से बाहर पक्षपाती monolayers के रूप में विकसित कोशिकाओं के रूप में कुछ के रूप में तीन 150 मिमी प्लेट का उपयोग किया जाता है. लघु निष्कर्षों की दक्षता का वर्णन करने के लिए, हम बताते हैं कि वे के रूप में युग्मित शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन / splicing प्रतिक्रियाओं के लिए थोक परमाणु अर्क के रूप में सक्रिय हैं. निकालने प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन, हम बताते हैं कि splicing HeLa सेल से तैयार अर्क में समाप्त कर दिया हैsplicing के अवरोध करनेवाला दवा E7107 के साथ इलाज किया. लघु प्रोटोकॉल आम तौर पर किसी भी प्रक्रिया या कोशिका प्रकार है कि इन विट्रो में जांच की जा सकता है सेलुलर निष्कर्षों का उपयोग करने के लिए लागू होना चाहिए. रोगी कोशिकाओं है कि केवल सीमित मात्रा में या कोशिकाओं दवाओं, डीएनए हानिकारक एजेंटों, आरएनएआई, या अभिकर्मक, जो छोटे सेल आबादी के उपयोग की आवश्यकता के रूप में कई एजेंटों के लिए संपर्क में उपलब्ध हैं शामिल हैं. इसके अलावा, हौसले से विकसित कोशिकाओं की छोटी मात्रा में सुविधाजनक और / या कुछ अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं.
Protocol
1. बढ़ता परमाणु निष्कर्षण के लिए HELA कोशिकाओं
- प्लेट HELA कोशिकाओं तीन 150 मिमी प्लेट पर DMEM मीडिया के साथ 10% FBS और 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक. 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बढ़ने तक कोशिकाओं 90% सहधारा के हैं.
टिप भाजित एक संगामी और बंटवारे के बाद 3 दिन थाली फसल के से 1:10 कोशिकाओं.
टिप - एक अतिरिक्त प्लेट मामले में उगाया जा सकता है वहाँ तीन प्लेटों के साथ पर्याप्त कोशिकाओं (उदाहरण के लिए, यदि कोशिकाओं को कम से कम 90% संगामी हैं) नहीं कर रहे हैं.
2. तैयार करने और परमाणु निकालें समाधान शांत
- ताजा समाधान तैयार तालिका 2 में उल्लिखित के रूप में.
- अशेष भाजक एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 10 मिलीलीटर Hypotonic बफर. उच्च नमक बफर और कम नमक बफर के 1 मिलीग्राम के 1 मिलीग्राम 1.5 मिलीग्राम Eppendorf ट्यूबों में अशेष भाजक. बर्फ पर buffers के शांत रहो. प्रत्येक बफर PMSF और डीटीटी की उचित मात्रा में जोड़ें तुरंत उपयोग करने के लिए पूर्व (देखें
3. परमाणु निष्कर्षण के लिए HELA कोशिकाओं कटाई
- कोशिकाओं से मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और कोशिकाओं कमरा तापमान 1X पीबीएस प्लेट प्रति के 13 मिलीग्राम के साथ एक बार धोना.
- पीबीएस धोने महाप्राण (व्यंजन).
पहली aspirating द्वारा के रूप में संभव के रूप में पीबीएस की बहुत टिप महाप्राण (व्यंजन), तो उसकी तरफ से थाली खड़ा है, कुछ ही सेकंड इंतज़ार कर रही है, और बाकी aspirating.
- एक सेल चोर का प्रयोग, प्लेट के नीचे किनारे करने के लिए कोशिकाओं नोच, और तब Eppendorf ट्यूब की कोशिकाओं को हस्तांतरण. बुलबुले बनाने से बचें. Scraped के कोशिकाओं के 3 प्लेटें एक 1.5 मिलीग्राम Eppendorf ट्यूब में फिट होना चाहिए.
टिप - यह आसान है अगर एक Eppendorf ट्यूब प्रयोग किया जाता है कोशिकाओं की मात्रा का अनुमान है. पैमाने के लिए ऊपर, फाल्कन ट्यूबों का उपयोग करें.
- 5 मिनट 100 पर गोली कोशिकाओं के लिए XG के लिए एक microfuge में डिग्री सेल्सियस 4 पर अपकेंद्रित्र.
4. Hypotonic बफर में HELA कोशिकाओं प्रफुल्लित
5. एक Dounce Homogenizer का उपयोग कक्ष Lyse
- Hypotonic बफर का उपयोग करने के लिए dounce कुल्ला और फिर यह बर्फ पर ठंडा. एक नाजुक कार्य WIP साथ मूसल सूखी पोछोएर (Kimwipe उदाहरण के लिए) एक 1000 μl विस्तारित micropipette टिप का उपयोग dounce से शेष बफर निकालें.
- Dounce में सूजन कोशिकाओं को हस्तांतरण. धीरे धीरे dounce की तंग मूसल कदम ऊपर और नीचे 5 बार कोशिकाओं lyse बुलबुले से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है.
- सेल सेल के लिए एक 5 dounce से कोशिकाओं की μl अशेष भाजक का उपयोग परख. Eppendorf ट्यूब में अशेष भाजक प्लेस और ब्लू Trypan के एक बराबर मात्रा में जोड़ें. मिश्रण को एक स्लाइड पर रखो और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं की जांच. lysed कोशिकाओं के नाभिक नीला दिखाई देगा. के बारे में 90% सेल आदर्श है.
टिप - बार कोशिकाओं dounced किया जाना चाहिए की संख्या dounce की तंगी के आधार पर अलग अलग होंगे. जब पहली बार के लिए इस प्रोटोकॉल को ले जाने, बार की संख्या निर्धारित करने के लिए dounce साथ प्रत्येक स्ट्रोक के बाद 5.3 कदम बाहर ले जाने से dounce. से अधिक dounce नहीं करना, अत्यधिक douncing नाभिक को नष्ट कर देगा.
- एक पूर्व - chille lysed कोशिकाओं स्थानांतरणघ Eppendorf ट्यूब और एक 4 डिग्री सेल्सियस microfuge में 1500 x जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन. गोली नाभिक शामिल हैं. ध्यान से नाभिक में बाधा पहुँचा के बिना एक नया ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. सतह पर तैरनेवाला cytoplasm शामिल हैं.
टिप - cytoplasm के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है या एक ही उच्च गति की थोक अर्क (थोक अर्क से सक्रिय S100 तैयारी के लिए 1 देखें) के लिए इस्तेमाल किया स्पिन का उपयोग करके आगे S100 के लिए संसाधित.
6. नाभिक नमक - निकालें
- ट्यूब पर उन्नयन पर देख कर, पैक्ड परमाणु वॉल्यूम (PNV) का अनुमान है. 500 μl की एक PCV आम तौर पर 400 μl की PNV पैदावार है.
- नाभिक को ट्यूब के नीचे करने के लिए एक micropipette टिप के डालने और धीरे धीरे धीरे जबकि मिश्रण नाभिक में बफर स्क्वरटिंग द्वारा साढ़े एक्स PNV कम नमक बफर जोड़ें. Pipet और नीचे मत करो. धीरे ट्यूबों झटका करने के लिए सुनिश्चित करें कि गोली पूरी तरह से जारी रखने से पहले कम नमक बफर में resuspended है. <li> जोड़ें साढ़े X PNV उच्च नमक बफर और जल्दी 1 inverting ट्यूब द्वारा समय मिश्रण की. हिला नहीं. 30 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 4 पर घुमाएँ.
जब वे उच्च नमक बफर में हैं उन्हें lysing से बचने के नाभिक के साथ कोमल सुझाव रहो.
- एक्स १८,००० जी पर 15 मिनट के लिए एक microfuge में डिग्री सेल्सियस 4 में स्पिन. सतह पर तैरनेवाला उच्च नमक परमाणु निकालने (एच एस पूर्वोत्तर) है. एच एस पूर्वोत्तर की कोशिकाओं के तीन प्लेटें आम तौर पर 500-600 μl उपज.
7. ध्यान केंद्रित करने और परमाणु निकालें Dialyze
- ठंडा (Amicon) मिनी centricons और 50 मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 14,000 एक्स जी microfuge में स्पिन में एच एस पूर्वोत्तर के 500 μl स्थानांतरण. मिनी centricon (Amicon) को कैपिटलाइज़ करें और यह एक नया Eppendorf ट्यूब में जगह है. 2 मिनट के लिए 4 में स्पिन डिग्री सेल्सियस 1000 के लिए एच एस पूर्वोत्तर ठीक XG. एच एस पूर्वोत्तर लगभग 115 μl के लिए ध्यान केंद्रित किया जाएगा.
- का प्रयोग एक P200 Pipetman के, एच एस पूर्वोत्तर के 45 μl aliquots के को मिनी डायलिसिस स्लाइड एक Lyzers में स्थानांतरित करने के लिए, और उन्हें 50 में जगह. ठंडा डायलिसिस बफर 0 मिलीलीटर. सुनिश्चित करें कि स्लाइड A-Lyzer के नीचे फ्लोटर के नीचे के साथ गठबंधन किया है. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए हलचल पूर्वोत्तर डायलिसिस के बाद बादल दिखाई देगा.
टिप - बादल वेग है कि डायलिसिस के बाद मनाया जाता है निकालने के लिए, के रूप में इस centrifugation निकालने की गतिविधि को कम कर देता है अपकेंद्रित्र नहीं.
- पूर्वोत्तर तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या aliquoted. Aliquots फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जाना चाहिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पूर्वोत्तर और संग्रहीत किया जा सकता है गतिविधि को खोने के बिना कम से कम दो फ्रीज पिघलना चक्र से गुजरना है.
8. प्रतिनिधि परिणाम
हाल ही, splicing RNAP द्वितीय प्रतिलेखन युग्मन के लिए इन विट्रो प्रणालियों में कुशल 2-5 विकसित किए गए. इन प्रणालियों HeLa थोक में विकसित कोशिकाओं कार्यरत हैं और इस तरह तेजी से कई नमूने पर विशिष्ट सेलुलर उपचार के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं. के आधार पर यह एक जरूरत हैएन डी लघु प्रोटोकॉल निकालने की सामान्य उपयोगिता (चर्चा देखें), हम एक मजबूत छोटे पैमाने पर परमाणु निकालने विधि की स्थापना की. प्रतिनिधि थोक परमाणु निकालने के साथ छोटे पैमाने पर परमाणु निकालने में RNAP द्वितीय प्रतिक्रिया / प्रतिलेखन splicing की तुलना डेटा चित्रा 2 में दिखाया गया है. एक सीएमवी डीएनए का निर्माण, जो सीएमवी प्रमोटर होते हैं और एक मानक splicing के सब्सट्रेट (3 Ftz 2A चित्रा) encodes के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था. जब इस निर्माण (1-3 गलियों) या लघु (4-6 गलियों) थोक निकालने में incubated किया गया था, पूर्व mRNA के नवजात के समान स्तर 5 मिनट का समय बिंदु (चित्रा 2, 1 और 4 गलियों के द्वारा संश्लेषित किया गया ). अलावा α-amanitin के आगे प्रतिलेखन ब्लॉक के बाद, splicing के मध्यवर्ती और spliced उत्पादों के अर्क के दोनों प्रकार की (चित्रा 2, 2 गलियों, 3, 5, 6) में समान कैनेटीक्स के साथ समय पर जमा है. ये प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं कि तख्तापलट की क्षमता नेतृत्व RNAP द्वितीय प्रणाली / प्रतिलेखन splicing के थोक और छोटे पैमाने पर परमाणु अर्क में समान है.
छोटे पैमाने पर विधि निकालने की उपयोगिता प्रदर्शन के अर्क, splicing के अवरोध करनेवाला, E7107, या नकारात्मक नियंत्रण परिसर pladienolide के एफ 6,7 और फिर मिलकर RNAP द्वितीय परख / प्रतिलेखन splicing के बाहर किया गया था के साथ इलाज HeLa कोशिकाओं से तैयार किया गया. के रूप में चित्रा 3, RNAP द्वितीय द्वारा प्रतिलेखन दोनों Pladienolide एफ और E7107 इलाज किया कोशिकाओं (10 मिनट समय अंक) से तैयार अर्क में कुशलतापूर्वक हुआ दिखाया. इसके विपरीत, splicing के Pladienolide एफ इलाज कोशिकाओं से तैयार निकालने में सामान्य रूप से हुआ लेकिन E7107 इलाज कोशिकाओं में समाप्त कर दिया गया था (चित्रा 3, 20-60 मिनट समय अंक). इन आंकड़ों की अवधारणा कोशिकाओं की विशेष इलाज के लिए छोटे पैमाने में छोटे पैमाने पर परमाणु निष्कर्षों का उपयोग करने के लिए सबूत प्रदान करते हैं.
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आकृति 1. लघु निकालें प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध P1 के कदम. कोशिकाओं monolayers के रूप में बड़े हो रहे हैं, प्लेटें एक सेल चोर का उपयोग कर से काटा और hypotonic बफर के अलावा द्वारा सूजन. P2 के कदम. कोशिकाओं एक Dounce homogenizer lysed का उपयोग कर रहे हैं और गोली के लिए नाभिक Centrifuged. पी 3 चरण. नाभिक cytoplasm से अलग हो रहे हैं और नमक निकासी से गुजरना. पी 4 कदम. परमाणु निकालने केंद्रित है और dialyzed. P5 कदम. परिणाम है कि शो कि परमाणु अर्क से कार्य कर रहे हैं (अधिक से अधिक विस्तार के लिए चित्र 2 देखें) प्राप्त कर रहे हैं.
चित्रा 2. छोटे पैमाने पर परमाणु अर्क मिलकर RNAP द्वितीय परख / प्रतिलेखन splicing में मजबूत कर रहे हैं ए. सीएमवी - Ftz डीएनए मिलकर RNAP प्रतिलेखन / splicing के द्वितीय के लिए इस्तेमाल किया टेम्पलेट की योजनाबद्ध. सीएमवी प्रमोटर और एक्सॉनों और intron आकार संकेत कर रहे हैं. मिलकर RNAP बी तुलनाद्वितीय / प्रतिलेखन splicing या तो थोक परमाणु निकालने या छोटे पैमाने पर परमाणु निकालने का उपयोग परख. α-amanitin प्रतिलेखन और splicing के 5 मिनट के बाद 30 और 60 मिनट के लिए होने की अनुमति दी गई थी जोड़ा गया है. शाही सेना निकाला गया था और एक 5% denaturing polyacrylamide जेल पर fractionated और phosphoimager द्वारा पता लगाया. splicing के मध्यवर्ती और उत्पादों का संकेत कर रहे हैं. अंतर्जात U6 snRNA और tRNA निकालने में उपस्थित कि ऊष्मायन दौरान 32 पी - लेबल संकेत कर रहे हैं. देखें मिलकर RNAP द्वितीय / प्रतिलेखन splicing प्रणाली पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए 3.
चित्रा 3. छोटे पैमाने पर परमाणु HeLa splicing के अवरोध करनेवाला दवा E7107 के साथ इलाज किया कोशिकाओं से तैयार अर्क splicing में खराब कर रहे हैं यह कोशिकाओं 3 माइक्रोन Pladienolide के साथ इलाज किया गया. एफ या E7107 के रूप में6 में वर्णित है और फिर छोटे पैमाने पर परमाणु अर्क तैयार किया है. एक बार पाठ्यक्रम चित्रा 2 में के रूप में एक ही परख / प्रतिलेखन splicing का उपयोग किया गया. splicing के मध्यवर्ती और उत्पादों, और से U6 snRNA और tRNA संकेत कर रहे हैं.
Discussion
हम HeLa monolayers के रूप में विकसित कोशिकाओं की छोटी मात्रा से परमाणु निष्कर्षों की तैयारी के लिए एक तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि की स्थापना की है. हमने दिखा दिया है कि इन निष्कर्षों दिखा रहा है कि RNAP द्वितीय / प्रतिलेखन और splicing assays के कैनेटीक्स और दक्षता छोटे पैमाने पर और थोक परमाणु अर्क में समान हैं द्वारा मजबूत कर रहे हैं. हम प्रदर्शन है कि एक splicing अवरोध करनेवाला दवा के साथ इलाज किया कोशिकाओं से तैयार अर्क प्रतिलेखन लेकिन splicing में दोषपूर्ण के लिए सक्रिय हैं अर्क की उपयोगिता से पता चला.
छोटे पैमाने पर परमाणु अर्क तैयार करने के लिए हमारी पद्धति संयोजन और अनुकूलन पहले HELA कोशिकाओं से निष्कर्षों 1,8 बड़े पैमाने में निलंबन में वृद्धि हुई और 9 के अर्क के छोटे पैमाने पर तैयारी के लिए एक विधि बनाने के लिए स्थापित तरीकों द्वारा स्थापित किया गया था. हम हमारे प्रोटोकॉल की स्थापना की है क्योंकि पिछले लघु निष्कर्षों कुछ assays के लिए कार्यात्मक, मिलकर प्रतिलेखन / सपा के रूप में नहीं थेपरख licing. पिछले लघु 9 प्रोटोकॉल और हमारे बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है कि हम एक dounce मिनी का उपयोग lysing कोशिकाओं के लिए शर्तों को अनुकूलित किया है जबकि पिछले प्रोटोकॉल उन्हें एक छोटे गेज सुई के माध्यम से 9 धकेलने के द्वारा कोशिकाओं lysed. बुलबुले में सुई lysis परिणाम है, जो समझा जा सकता है क्यों निष्कर्षों को निष्क्रिय और / या मुश्किल कुछ assays के लिए पुन: पेश करने थे. हम भी एक एकाग्रता हमारी प्रोटोकॉल के लिए कदम जोड़ा. यह कदम अर्क, जो अत्यंत एकाग्रता के प्रति संवेदनशील हैं की गतिविधि बढ़ जाती है, और भी सीमा अर्क के बीच परिवर्तनशीलता है कि छोटे पैमाने पर तैयारी करने के लिए निहित है. अंत में, हमारी तैयारी नियमित monolayer की कोशिकाओं के तीन केवल 150 मिमी प्लेट के साथ बाहर गतिविधि पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव थोक निष्कर्षों की तुलना में बिना किया जाता है. इस प्रकार, प्रक्रिया आसानी से छोटे पैमाने पर तैयारियाँ कि महंगा अभिकर्मकों या सीमित कक्ष उपलब्धता की आवश्यकता के लिए उत्तरदायी है. उदाहरण के लिए, हम sma तैयार हैआरएनएआई पछाड़ना कोशिकाओं से और चिरकारी Lymphocytic लेकिमिया (CLL) रोगी कोशिकाओं से करेंगे पैमाने पर अर्क, और कार्यात्मक और / या जैव रासायनिक assays (EGF, JLH, TY और आर आर, अप्रकाशित) के लिए इन निष्कर्षों का इस्तेमाल किया. हमने पाया है कि मूल्यवान अर्क के लिए आरएनएआई immunopreciptations, पाश्चात्य, और चांदी धुंधला जैसे विशिष्ट जैव रासायनिक assays, द्वारा पीछा किया. नीचे एक विशेष प्रोटीन दस्तक की प्रभावकारिता की स्थापना के बाद, एक स्थिर सेल लाइन पछाड़ना है, जो कम लागत पर अतिरिक्त अर्क तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बनाने के द्वारा एक अधिक विस्तृत अध्ययन बाहर ले सकते हैं. प्रोटीन का मास स्पेक्ट्रोमेट्री में मौजूद इन पछाड़ना सेल लाइनों से प्राप्त immunoprecipitates भी विधि का एक उपयोगी आवेदन किया जाएगा. मिलकर परख / प्रतिलेखन splicing है कि हम हमारे प्रोटोकॉल विवरण यहाँ के लिए एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल करने के अलावा, लघु निष्कर्षों को आम तौर पर कई कार्यात्मक और जैव रासायनिक assays के लिए लागू विभिन्न सेंट के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में होना चाहिएजीन अभिव्यक्ति में eps (कैपिंग, splicing है, प्रतिलेखन, polyadenylation, microRNA प्रसंस्करण जैसे). प्रोटोकॉल भी रोगी कोशिका प्रकार है कि या तो निलंबन में प्राप्त किया जा सकता है (जैसे CLL कोशिकाओं के रूप में) या संस्कृति में हो (जैसे रोगी fibroblasts) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. अंत में, cytoplasmic प्रक्रिया के दौरान प्राप्त अंश दोनों कार्यात्मक और जैव रासायनिक assays कि cytoplasm आवश्यकता होती है के लिए उपयोगी साबित करना चाहिए.
Disclosures
उत्पादन और इस लेख के लिए नि: शुल्क प्रवेश Abcam, पीएलसी द्वारा प्रायोजित है.
Acknowledgments
हम Winkelbauer - चोट, एम. ई. इब्राहिम, पी. वालेंसिया, लालकृष्ण दू फ़ू, एच. चेंग उपयोगी विचार विमर्श के लिए आभारी हैं. HELA कोशिकाओं राष्ट्रीय सेल संस्कृति केंद्र (Minneapolis, MN) से प्राप्त किया गया. हम भी हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में E7107 और Nikon इमेजिंग सेंटर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ मदद के लिए उपलब्ध कराने के लिए Eisai कं, लिमिटेड धन्यवाद. यह काम एक NIH GM043375 अनुदान आरआर और EGF और एनआरएसए फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया JLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
| MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
| KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
| PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
| DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
| EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
| Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
| DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
| FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
| 150mm Plates | VWR | 353025 | |
| Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
| Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
| Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
| Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 | |
| Table 1. Specific Reagents and Equipment. | |||
| Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
| 10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
| 100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
| 20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation. | |||
References
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