Summary
En protokol for forberedelse af robuste, små HeLa nukleare ekstrakter er beskrevet. Denne protokol er værdifuldt for assays, der kræver brug af små populationer af celler, såsom celler behandlet med lægemidler eller RNAi. Fremgangsmåden bør anvendes til en lang række genekspressionssystemer assays og andre celletyper, herunder patientens celler.
Abstract
En stor del af fremskridt i forståelsen genekspression er blevet gjort brug af in vitro-systemer. For de fleste undersøgelser, der funktionelle assays udføres under anvendelse af ekstrakter, der er fremstillet i bulk fra 10-50 eller flere liter celler dyrket i suspension. Disse store præparater er ikke egnet til hurtigt at teste in vitro virkninger, der resulterer fra en række af in vivo cellulære behandlinger eller tilstande. Denne tidsskrift video artikel viser en fremgangsmåde til fremstilling af funktionelle mindre kerneekstrakter under anvendelse af HeLa-celler som et eksempel. Denne fremgangsmåde udføres ved anvendelse af så få som tre 150 mm plader af celler dyrket som adhærente monolag. For at illustrere effektiviteten af de små ekstrakter, viser vi, at de er så aktive som bulk-nukleare ekstrakter til koblede RNA-polymerase II transskriptions / splejsning reaktioner. For at demonstrere anvendeligheden af ekstrakt-protokollen, viser vi, at splejsning er afskaffet i ekstrakter fremstillet fra HeLa-celles behandlet med splejsning inhibitoren lægemidlet E7107. Den lille skala Protokollen skal være generelt anvendelige til proces-eller celletype, der kan undersøges in vitro ved hjælp af cellulære ekstrakter. Disse omfatter patientens celler, der kun findes i begrænsede mængder eller celler udsat for en række midler, såsom lægemidler og DNA-skadende agenter, RNAi eller transfektion, som kræver brug af små cellepopulationer. Desuden er små mængder frisk dyrkede celler bekvem og / eller kræves til nogle anvendelser.
Protocol
1. Voksende HeLa celler for Nuclear Extraction
- Plade HeLa-celler på tre 150 mm plader med DMEM-medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin. Vokse i et 37 ° C inkubator med 5% CO2, indtil cellerne er 90% sammenflydende.
Tip-Split celler 1:10 fra en sammenflydende plade og høst 3 dage efter spaltning.
Spids-en ekstra plade kan dyrkes i tilfælde er der ikke nok celler med tre plader (for eksempel hvis cellerne er mindre end 90% konfluente).
2. Forberede og Chill kerneekstrakten Solutions
- Forbered friske løsninger som skitseret i tabel 2.
- Portion 10 ml hypotonisk puffer i en 15 ml Falcon-rør. Aliquot 1 ml højsaltpuffer og 1 ml lavsaltpuffer i 1,5 ml Eppendorf-rør. Køling af buffere på is. Tilsættes de passende mængder PMSF og DTT til hver buffer umiddelbart før brug (se
3. Høst HeLa celler for Nuclear Extraction
- Aspirere medier fra cellerne, og der vaskes cellerne en gang med 13 ml stuetemperatur 1X PBS per plade.
- Aspirer PBS vask.
Spids-Aspirer så meget af PBS som muligt ved først at bortsuge derefter stå pladen på sin side, vente et par sekunder og opsugning resten.
- Ved hjælp af en celle løfteren, skrabes celler til bundkanten af pladerne, og derefter overføre cellerne til et Eppendorf-rør. Undgå at lave bobler. De 3 plader skrabet celler skal passe ind i en 1,5 ml eppendorfrør.
Tip-Det er lettere at beregne mængden af celler, hvis en Eppendorf-rør anvendes. For skala, skal du bruge Falcon-rør.
- Centrifugeres ved 4 ° C i en mikrofuge i 5 minutter ved 100 xg at pelletere cellerne.
4. Kvælder HeLa-celler i hypotonisk buffer
5. Lysere cellerne med en Dounce-homogenisator
- Anvende hypotonisk puffer at skylle dounce og derefter afkøle den på is. Tør støderen tørt med en delikat opgave WIPER (f.eks Kimwipe). Fjerne det resterende buffer fra den Dounce anvendelse af en 1000 ul forlænget mikropipettespids.
- Overfør hævede celler i dounce. Langsomt bevæger den stramme støderen af dounce op og ned 5 gange for at lysere cellerne, være omhyggelig med at undgå bobler.
- Assay for cellelyse under anvendelse af en 5 pl portion af celler fra den Dounce. Anbring alikvot i et Eppendorf rør, og der tilsættes et lige volumen af Trypan Blue. Sættes til blandingen på et objektglas og undersøge cellerne under anvendelse af et lysmikroskop. Kernerne af lyserede celler vises blåt. Omkring 90% lysis er ideel.
Tip-Antallet af gange celler bør dounced vil variere afhængigt af tætheden af den Dounce. Ved gennemførelsen af denne protokol for første gang, at bestemme antallet af gange for at Dounce ved at udføre trin 5,3 efter hver slag med dounce. Må ikke over-dounce, vil overdreven douncing ødelægge kerner.
- Overføre de lyserede celler til en præ-chilled Eppendorf-rør og centrifugering i en 4 ° C mikrofuge i 5 minutter ved 1500 x g. Pelleten indeholder kerner. Omhyggeligt overføre supernatanten til et nyt rør uden at forstyrre kernerne. Supernatanten indeholder cytoplasmaet.
Spids-cytoplasmaet, kan anvendes som det er eller bearbejdes yderligere til en S100 ved hjælp af samme høje hastighed centrifugering anvendes til bulk-ekstrakter (se 1 til fremstilling af en aktiv S100 fra bulk-ekstrakter).
6. Salt-Uddrag kerner
- Vurdere Medbragt Nuclear Volume (PNV) ved at kigge på graduering på røret. En PCV af 500 pi giver typisk en PNV på 400 pi.
- Tilsættes ½ X PNV lavsaltpuffer til kernerne ved at indsætte en mikropipettespids til bunden af røret og langsomt sprøjtes pufferen i kernerne under moderat blanding. Må ikke pipette op og ned. Forsigtigt svirp rørene for at sikre, at pelleten er fuldstændig resuspenderes i puffer med lavt saltindhold før der fortsættes. <li> Tilføj ½ X PNV af højsaltbuffer hurtigt og bland 1 gang ved at vende røret. Ryst ikke. Roterer ved 4 ° C i 30 minutter.
Tip-Vær blid med kernerne, når de er i høj saltpuffer at undgå lyse dem.
- Spinde ved 4 ° C i en mikrofuge i 15 minutter ved 18.000 x g. Supernatanten er højt saltindhold kerneekstrakt (HS-NE). Tre plader af celler giver typisk 500-600 pi HS-NE.
7. Koncentrat og Dialyser kerneekstrakten
- Overfør 500 ul af HS-NE i kølede mini-centricons (Amicon) og centrifugering i 50 minutter ved 4 ° C i en mikrofuge ved 14.000 x g. Vend mini-Centricon (Amicon) og læg den i et nyt eppendorfrør. Spin i 2 min ved 4 ° C 1000 xg at genvinde HS-NE. HS-NE koncentreres til ca 115 ul.
- Ved hjælp af en P200 Pipetman, 45 gl portioner af HS-NE overføre til mini-dialyse Slide-A-Lyzers, og læg dem i 500 ml afkølet dialysebuffer. Sikre, at bunden af Slide-A-Lyzer flugter med bunden af flyderen. Omrøres i 1-2 timer ved 4 ° C. NE vises overskyet efter dialyse.
Spids-ikke centrifugeres for at fjerne den uklare bundfald, som observeres efter dialyse, da dette centrifugering nedsætter aktiviteten af ekstraktet.
- NE kan anvendes straks eller alikvoteret. Alikvoter bør lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. NE kan opbevares og underkastes mindst to fryse-tø-cykler uden at miste aktivitet.
8. Repræsentative resultater
For nylig blev en effektiv in vitro-systemer til at koble RNAP II transkription splejsning udviklet 2-5. Disse systemer anvendes HeLa-celler dyrket i bulk og dermed er uegnede til hurtigt at teste virkningerne af specifikke cellulære behandlinger på flere prøver. Baseret på dette behov for ennd den generelle anvendelighed af en mindre ekstrakt protokol (se Diskussion), etablerede vi en robust lille skala nukleare ekstrakt metoden. Repræsentative data, der sammenligner den RNAP II transskription / splejsning reaktion i lille målestok kerneekstrakt med størstedelen kerneekstrakt er vist i figur 2. En CMV-DNA-konstruktionen, der indeholder CMV-promotoren og koder for et standard splejsning substrat (FTZ 3, figur 2A) blev anvendt til analysen. Når denne konstruktion blev inkuberet i størstedelen (bane 1-3) eller mindre (bane 4-6) ekstrakt blev tilsvarende niveauer af spirende præ-mRNA syntetiseres ved 5 min tidspunkt (fig. 2, bane 1 og 4 ). Efter tilsætning af α-amanitin at blokere for yderligere transkription, akkumuleret de splejsnings mellemprodukter og splejsede produkter med tiden lignende kinetik i begge typer ekstrakter (fig. 2, bane 2, 3, 5, 6). Disse repræsentative resultater viser, at effektiviteten af kup ledede RNAP II transskription / splejsning systemet er ens i de bulk-og små nukleare ekstrakter.
At påvise anvendeligheden af små ekstrakt fremgangsmåde blev ekstrakter fremstillet ud fra HeLa-celler behandlet med splejsning inhibitor, E7107, eller den negative kontrol forbindelsen pladienolide F 6,7 og derefter koblede RNAP II transkription / splejsning assay blev udført. Som vist i figur 3, transkription af RNAP II forekom effektivt i ekstrakter fremstillet ud fra både Pladienolide F og E7107-behandlede celler (10 min tidspunkter). I modsætning hertil forekom splejsning normalt i ekstrakten fremstillet ud fra Pladienolide F-behandlede celler, men blev fjernet i E7107-behandlede celler (fig. 3, 20-60 min tidspunkter). Disse data giver proof of concept for at bruge de små nukleare ekstrakter til speciel behandling af celler i lille skala.
jpg "/>
Figur 1. Skematisk af mindre Ekstrakt protokollen. Trin P1. Cellerne dyrkes som monolag, høstet fra pladerne under anvendelse af en celle løfter og kvældet ved tilsætning af hypotonisk puffer. Trin P2. Celler lyseres ved anvendelse af en Dounce-homogenisator og centrifugeres for at pelletere kernerne. Trin P3. Kerner er adskilt fra cytoplasmaet og undergå salt ekstraktion. Trin P4. Kerneekstrakten koncentreres og dialyseret. Trin P5. Resultater opnås der viser, at kerneekstrakter er funktionelle (se figur 2 for mere detaljeret).
Figur 2. Mindre nukleare ekstrakter er robuste i en koblet RNAP II transskription / splejsning analysen. A. Skematisk afbildning af CMV-FTZ DNA-template anvendes koblet RNAP II transkription / splejsning. CMV-promotoren og størrelser af exoner og intron er angivet. B. Sammenligning af koblet RNAPII transskription / splejsning analysen ved hjælp af enten bulk-nukleare ekstrakt eller små nukleare ekstrakt. α-amanitin blev tilsat efter 5 min i Transcription and splicing lodes foregå i 30 og 60 min. RNA blev ekstraheret og fraktioneret på en 5% denaturerende polyacrylamidgel og detekteret ved phosphoimager. De splejsning mellemprodukter og produkter er angivet. Den endogene U6 snRNA og tRNA til stede i ekstraktet, og som er 32 P-mærket under inkuberingen er angivet. Se 3 for en detaljeret protokol om koblede RNAP II transskription / splejsning system.
Figur 3. Mindre nukleare ekstrakter fremstillet ud fra HeLa-celler behandlet med splejsning inhibitoren lægemidlet E7107 er defekte i splejsning. Celler blev behandlet med 3 uM Pladienolide F eller E7107 sombeskrevet 6 og derefter anvendt til at fremstille små kerneekstrakter. Et tidsforløb blev udført under anvendelse af samme transkriptions / splejsning assay som i figur 2. De splejsning mellemprodukter og produkter, og U6 snRNA og tRNA er angivet.
Discussion
Vi har etableret en hurtig og reproducerbar metode til fremstilling af nukleare ekstrakter fra små mængder af HeLa-celler dyrket som monolag. Vi viste, at disse uddrag er robuste ved at vise, at kinetik og effektiviteten af RNAP II transskriptions / splejsning analyser er ens i de små og bulk-nukleare ekstrakter. Vi viste anvendeligheden af ekstrakterne ved at påvise, at ekstrakter fremstillet fra celler behandlet med en splejsning inhibitor lægemiddel er aktive til transkription, men defekt i splejsning.
Vores metode til fremstilling af små nukleare ekstrakter blev etableret ved at kombinere og optimere metoder, der tidligere er fastsat for at ekstrakter fra HeLa-celler dyrket i suspension i stor skala 1,8 og en metode for små-skala fremstilling af ekstrakter 9. Vi etableret vores protokol, da de foregående små ekstrakter ikke var funktionelle i nogle assays, såsom koblet transkription / splicing assay. En vigtig forskel mellem den tidligere små protokol 9 og vores er, at vi optimerede betingelser for at lysere cellerne ved anvendelse af en mini-dounce hvorimod den foregående protokol lyserede celler ved at skubbe dem gennem en lille kanyle 9. Nålen-lyse resulterer i bobler, der kan forklare, hvorfor de uddrag var inaktive og / eller vanskelige at reproducere for nogle analyser. Vi har også tilføjet en koncentration skridt til vores protokol. Dette trin forøger aktiviteten af de ekstrakter, som er meget følsomme over for koncentration og begrænser også variabiliteten mellem ekstrakter, der er uløseligt forbundet med små præparater. Endelig er vores forberedelse rutinemæssigt gennemføres med kun tre 150 mm plader af monolag af celler, uden nogen signifikant effekt på aktiviteten i forhold til bulk-ekstrakter. Således er proceduren er let modtagelig for små præparater, der kræver dyre reagenser eller begrænset celle tilgængelighed. For eksempel har vi forberedt SMAll-skala uddrag fra RNAi Knockdown celler og fra kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) patients celler og brugt disse ekstrakter til funktionelle og / eller biokemiske analyser (EGF, JLH, TY og RR, upubliceret). Vi har fundet, at ekstrakterne er værdifulde for RNAi efterfulgt af specifikke biokemiske assays, såsom immunopreciptations og Westerns og sølvfarvning. Efter etablering af effektiviteten af vælte et bestemt protein, kan en mere detaljeret undersøgelse udføres ved at foretage en stabil knockdown cellelinje, som kan anvendes til fremstilling af yderligere ekstrakter med lavere omkostninger. Massespektrometri af proteiner til stede i immunopræcipitater fra disse knockdown cellelinjer vil også være en nyttig anvendelse af fremgangsmåden. Ud over den koblede transkriptions / splejsning assay, som vi som et eksempel for vores protokol beskrivelse her, bør de små ekstrakter være generelt anvendelig til mange funktionelle og biokemiske assays, såsom dem der anvendes til forskellige stEPS i genekspression (fx capping, splejsning, transkription, polyadenylering, microRNA behandling). Protokollen kan også tilpasses til patientens celletyper, som kan enten opnås i suspension (såsom CLL-celler) eller dyrket i kultur (såsom patientens fibroblaster). Endelig bør den cytoplasmatiske fraktion opnået under proceduren være nyttigt for både funktionelle og biokemiske assays, der kræver cytoplasmaet.
Disclosures
Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Abcam, Plc.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng for nyttige drøftelser. HeLa-celler blev opnået fra National Cell Culture Center (Minneapolis, MN). Vi takker også Eisai Co, Ltd for at give E7107 og Nikon Imaging Center på Harvard Medical School for at få hjælp med lys mikroskopi. Dette arbejde blev støttet af en NIH tilskud GM043375 til RR og EGF og NRSA stipendium til JLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
| MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
| KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
| PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
| DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
| EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
| Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
| DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
| FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
| 150mm Plates | VWR | 353025 | |
| Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
| Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
| Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
| Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 | |
| Table 1. Specific Reagents and Equipment. | |||
| Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
| 10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
| 100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
| 20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation. | |||
References
- Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro. Cell. 36, 993-1005 (1984).
- Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts. Rna. 6, 1325-1334 (2000).
- Das, R. Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly. Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).
- Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns. PLoS Biol. 4, e147 (2006).
- Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. A model in vitro system for co-transcriptional splicing. Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).
- Kotake, Y. Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide. Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).
- Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region. Genes. 25, 440-444 (2011).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing. Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).
