Summary

Herstellung und Verwendung von Mikroumgebung Microarrays (MEArrays)

Published: October 11, 2012
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Summary

Eine kombinatorische funktionelle Screening-Methode für Einblicke in die Auswirkungen der molekularen Zusammensetzung der Mikroumgebung auf zelluläre Funktionen beschrieben. Das Verfahren nutzt bestehende Biochip-basierten Technologien, um Arrays von definierten kombinatorischen Mikroumgebungen, dass Zelladhäsion und funktionelle Analyse unterstützt generieren.

Abstract

Die Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Umgebung Mikroumgebung funktionelle Konsequenzen für zelluläres Verhalten. Auf der einzigen Zelle Ebene können unterschiedliche Mikroumgebungen verhängen Differenzierung, Migration und Proliferation Phänotypen, und auf der Gewebe-Ebene die Mikroumgebung verarbeitet so komplex wie Morphogenese und Tumorentstehung 1. Nicht nur, dass die Zell-und Molekularbiologie Inhalt Mikroumgebungen Auswirkungen die Zellen innerhalb, aber so tun die Elastizität 2 und Geometrie 3 des Gewebes. Definiert als die Summe der Zell-Zell-,-ECM und löslichen Faktor Wechselwirkungen neben physikalischen Eigenschaften ist der Mikroumgebung komplex. Die Phänotypen von Zellen innerhalb eines Gewebes sind teilweise auf Grund ihrer genomischen Inhalt und teilweise auf die Wechselwirkungen mit der kombinatorischen microenviroment. Eine große Herausforderung ist es, bestimmte Kombinationen von Mikroumgebung Komponenten mit charakteristischen Verhaltensweisen zu verknüpfen.

ent "> Hier präsentieren wir die Mikroumgebung Mikroarray (MEArray)-Plattform für zellbasierte funktionelles Screening von Wechselwirkungen mit kombinatorischen Mikroumgebungen 4. Das Verfahren erlaubt die gleichzeitige Steuerung der molekularen Zusammensetzung und der Elastizitätsmodul und kombiniert die Verwendung von allgemein verfügbar Microarray und Mikrostrukturierung Technologien. MEArray Bildschirme benötigen so wenige wie 10.000 Zellen pro Array, welches funktionelle Studien von seltenen Zelltypen wie adulte Progenitorzellen erleichtert. Eine Begrenzung der Technik ist, dass ganze Gewebe Mikroumgebungen nicht vollständig auf MEArrays rekapituliert werden. jedoch Vergleich Antworten in der gleichen Zelltyp zu zahlreichen verwandten Mikroumgebungen beispielsweise paarweise Kombinationen von ECM-Proteinen, die eine gegebene Gewebes zu charakterisieren, werden Erkenntnisse, wie Mikroumgebungsbedingungen Komponenten hervorzurufen gewebespezifischen funktionellen Phänotypen bereitzustellen.

MEArrays gedruckt unter Verwendung einer Vielzahl von rekombinantem gro werdenwth Faktoren, Cytokine und gereinigtes ECM Proteine, und Kombinationen davon. Die Plattform wird nur durch die Verfügbarkeit von spezifischen Reagenzien begrenzt. MEArrays zugänglich sind Zeitraffer Analyse, aber am häufigsten für Endpunkt-Analysen von Zellfunktionen, die messbar sind mit fluoreszierenden Sonden verwendet. Zum Beispiel werden DNA-Synthese, Apoptose, Akquisition von differenzierten Zustände oder Produktion spezifischer Genprodukte häufigsten gemessen. Kurz gesagt, ist der grundlegende Ablauf eines MEArray Experiment Folien mit Druck Substrate beschichtet vorzubereiten und die Master-Platte von Proteinen, die gedruckt werden sollen, vorbereitet. Dann werden die Arrays mit einem Mikroarray-Roboter gedruckt werden Zellen erlaubt zu befestigen, in Kultur zu wachsen, und werden dann chemisch bei Erreichen der experimentellen Endpunkt fixiert. Fluoreszierenden oder kolorimetrische Assays, mit traditionellen Mikroskopen oder Microarrayscannern abgebildet wird, werden verwendet, um relevante molekularen und zellulären Phänotypen (Abbildung 1) offenbaren.

Protocol

Ein. Printing Substrata Vorbereitung Die Entscheidung, Polydimethylsiloxan (PDMS)-beschichteten oder Polyacrylamid (PA)-beschichteten Folien verwenden, hängt von den wichtigsten Parameter des experimentellen Designs. Der Elastizitätsmodul der beiden Polymere kann abgestimmt, um die Steifigkeit der verschiedenen Geweben durch Veränderung des Base / Heilung Verhältnis von PDMS und das Acrylamid / Bisacrylamid-Verhältnis von PA imitieren. PDMS kann steifer Geweben in dem Bereich von 1-10MPa …

Discussion

Die MEArray hier vorgestellte Methode ermöglicht funktionelle Analysen von Zell-und kombinatorischen Mikroumgebung Interaktionen 4. MEArray Analyse kombiniert Verwendung von basischen Mikrostrukturierung Technologien, Zellbiologie, und Microarray-Druck Roboter und Analyse-Geräte, die in vielen Multiuser-Labore sind. MEArray Bildschirme sind kompatibel mit den meisten adhärente Zelltypen, wenn serumfreie Medien Formulierungen müssen möglicherweise in einigen Fällen eingestellt werden zu BSA oder <1% S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ML wird von der NIA (R00AG033176 und R01AG040081) und Laboratory Directed Forschung und Entwicklung, US Department of Energy contract # DE-AC02-05CH11231 unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments (optional)
Glass slides 25 mm x 75 mm VWR 48311-600
Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm VWR 48393-241
Staining dish (or Coplan jar) VWR 25461-003
Petri dishes (15 cm) BD Falcon 351058
NaOH (1.0N) Sigma-Aldrich S2567
APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) Sigma-Aldrich A3648
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G7651 50% in water
APS (>98% Ammonium Persulfate) Sigma-Aldrich A3678 Prepare 10% working solution with ddH2O
TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) Sigma-Aldrich T9281
Acrylamide (40%) Sigma-Aldrich A4058
Bis-Acrylamide (2% w/v) Fisher BioReagents BP1404-250
0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon Nalgene 176-0045
FITC Sigma-Aldrich F4274
PDMS (polydimethylsiloxane) Dow Corning 3097358-1004 Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives
2-chamber slides NUNC 177380
Pluronic F108 BASF 30089186
Aquarium sealant Dow Corning DAP 00688
Fluormount-G Southern Biotech 0100-01
Disposable plastic cups
Tongue depressors
Nitrile gloves
Plastic microscope slide boxes
Spin coater WS-400B-6NPP/LITE Laurell Technologies Corporation
Oven
Digital hotplate
384-well plates A brand appropriate for the microarray robot
Microarray printing robot
Inverted phase and fluorescence microscope
Axon microarray scanners Molecular Devices Multiple configurations exist

References

  1. Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
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Cite This Article
Lin, C., Lee, J. K., LaBarge, M. A. Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays). J. Vis. Exp. (68), e4152, doi:10.3791/4152 (2012).

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