Summary
उपन्यास वर्तमान अध्ययन में रिपोर्ट प्रोटोकॉल संयुक्त द्वारा चूहों में एकल कक्ष संकल्प पर फेफड़ों metastases के चुनिंदा पता लगाने की अनुमति देता है
Protocol
1. फेफड़ों में सीटू परफ्यूज़न और फिक्सेशन
- ~ 150 μl फॉस्फेट के आईपी इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize buffered खारा (पीबीएस) ketamine 112.5 मिलीग्राम / किग्रा (शरीर के वजन), 16.5 xylazine मिलीग्राम / किग्रा, और 15 मिलीग्राम / किग्रा acepromazine (या और उचित दर्द हत्यारों युक्त संज्ञाहरण द्वारा).
- जब माउस की सजगता नहीं रह मनाया जाता है, यह ऑपरेटिंग मेज पर वापस नीचे ठीक करने के लिए और 70% इथेनॉल के साथ फर गीला चालाक नीचे बाल.
- गर्दन को पेट से त्वचा खोलें और पक्षों को खींचने के लिए या इसे हटा दें.
- पेरिटोनियम और एक पर्याप्त आकार के लिए छाती खोलें. बड़े वाहिकाओं के ruptures (जैसे रग jugularis) को रोकने के के बाद छिड़काव के कम क्षमता से बचने के लिए.
- वेना कावा caudalis जिगर के नीचे कट.
- एक 20 मिलीलीटर एक 21g साथ सुसज्जित सिरिंज का प्रयोग करें - 24g सुई दिल की धड़कन की सही वेंट्रिकल में धीरे धीरे 10-15 मिलीलीटर पीबीएस इंजेक्षन जब तक फेफड़ों पूरी तरह से सफेद है औरदिल की धड़कन (हृद् - अप्रकुंचन संबंधी) बंद हो जाता है.
- जिगर और डायाफ्राम ऊपर रक्त वाहिकाओं चुटकी एक संवहनी क्लैंप के साथ बंद.
- 24g सुई ~ सही वेंट्रिकल में 3% paraformaldehyde के 2 मिलीलीटर (पीएफए) इंजेक्षन पीबीएस में एक 10 मिलीलीटर के साथ सुसज्जित एक 21g सिरिंज का प्रयोग करें.
- छाती के बाहर ट्रेकिआ उजागर. एक ही सिरिंज का उपयोग करने के लिए पीबीएस कपाल (छाती के बाहर) ट्रेकिआ में 3% पीएफए की ~ 3 मिलीलीटर तक फेफड़ों फुलाया जाता है इंजेक्षन. सुई के हटाने के तुरंत बाद, एक संवहनी क्लैंप के साथ बंद पंचर की ट्रेकिआ लांगुलिय चुटकी और 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए निर्धारण की अनुमति देने के लिए.
- संवहनी क्लैंप ऊपर रक्त वाहिकाओं आड़ा काट, क्लैंप को हटाने और सही अतिरिक्त पीएफए हटाने निलय में ~ 2 मिलीलीटर पीबीएस इंजेक्षन.
- एक सुई के साथ सभी फेफड़ों lobes के निचले हिस्सों के बीच में रोकना, ट्रेकिआ में संवहनी क्लैंप को हटाने और PolyFreeze की एक समाधान के 3-5 मिलीलीटर इंजेक्षन में पीएफए तक 1 पंचर ट्रेकिआ लांगुलिय में मध्यम / पीबीएस 01:01 embedding फेफड़ाlobes समाधान की जगह है.
- एक संदंश के साथ दिल खींच द्वारा और संयोजी ऊतक स्नायुबंधन, रक्त वाहिकाओं और ट्रेकिआ transecting द्वारा फेफड़ों ध्यान से निकालें. फेफड़ों के लिए जुड़े दिल रखो.
- फेफड़े के ऊतकों विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने के लिए पर निर्भर करता है 2 या 3 वर्गों में उल्लिखित प्रोटोकॉल के साथ जारी है. यदि आप दोनों विश्लेषण करना चाहते हैं, एक फेफड़ों पालि हटाने और आगे बढ़ने के रूप में 3 के तहत वर्णित है. शेष दिल से जुड़े के रूप में 2 के तहत वर्णित lobes संसाधित.
2. LacZ टैग पूरे फेफड़ों lobes में metastatic ट्यूमर कोशिकाओं की विज़ुअलाइज़ेशन
- तंग समापन ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक के कप में फेफड़े और प्लेस पीबीएस में 2% formaldehyde के साथ 30-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठीक.
- नियतन समाधान निकालें और पीबीएस के साथ 3 बार अच्छी तरह से धो लो.
- कम से कम 10 मिलीलीटर हौसले से 5-ब्रोमो 4 - क्लोरो 3 - indolyl-β-D-galactoside धुंधला हो जाना (एक्स - लड़की) समाधान (स्टॉक समाधान एक्स लड़की [40 मिलीग्राम / एमएल में तैयार जोड़ेंDimethylformamide] 1:40 मूल धुंधला समाधान में पतला, 7.1 पीएच (1 टेबल), प्रकाश से बचाने के लिए).
- स्विमिंग फेफड़ों के शीर्ष पर धुंध के एक टुकड़े के लिए यह पूरी तरह से समाधान में और रखने के ढक्कन केवल शिथिल पॉट पर हवा के आदान - प्रदान की अनुमति देने के लिए जगह रखो.
- 3-5 घंटे प्रकाश से संरक्षित के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- एक्स - लड़की समाधान निकालें, पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला अवशिष्ट एक्स लड़की समाधान (वैकल्पिक) को हटाने के लिए और 4% पीएफए जोड़ें.
3. LacZ टैग फेफड़े Cryosections में metastatic ट्यूमर कोशिकाओं की विज़ुअलाइज़ेशन
- Prefill undiluted PolyFreeze embedding मध्यम के साथ एक लेबल embedding / 1 3 ढालना. शीर्ष पर फेफड़ों पालि रखो और मध्यम embedding तक पालि पूरी तरह से कवर किया जाता है के साथ भरने. बुलबुले को रोकने की कोशिश करो.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एम्बेडेड फेफड़ों सेते हैं.
- तब -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ और Isopentane और दुकान का एक मिश्रण में धीरे धीरे एम्बेडेड फेफड़ों फ्रीज
- 7-10 सुक्ष्ममापी क्रायो कटएक cryostat पर वर्गों और उन्हें SuperFrostPlus खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट.
- वर्गों तुरंत एक्स - लड़की धुंधला हो समाधान के साथ एक humidified कक्ष में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- आसुत पानी में 5 मिनट और फिर कुछ समय के लिए पीबीएस 2 बार में स्लाइड कुल्ला.
- 10-30 सेकंड के लिए परमाणु तेजी से लाल रंग के साथ काउंटर दाग, आसुत जल में कुल्ला और immu माउंट के साथ स्लाइड्स माउंट.
4. प्रतिनिधि परिणाम
Asai एट अल. Dunn व्युत्पन्न LM8 ओएस माउस मॉडल पर मूल लेख है कि सुप्रीम कोर्ट प्राथमिक माता पिता डन कोशिकाओं से व्युत्पन्न ट्यूमर, अत्यधिक metastatic LM8 उप सेल लाइन से प्राप्त उन लोगों से अलग है, अनायास detectable फेफड़ों metastases फार्म नहीं करते में रिपोर्ट syngeneic C3H 14 चूहों. यहाँ की सूचना तकनीक के साथ, हम माउस Dunn/LM8 ओएस मॉडल में metastases के गठन reinvestigated. हम स्थिर lacZ transduced डन और LM8 सेल का फायदा उठायाऔर में सीटू फेफड़ों और चूहों में छिड़काव निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल का. Subcutaneously इंजेक्शन के साथ चूहों के perfused और गैर perfused फेफड़ों के प्रतिनिधि छवियों lacZ transduced और गैर transduced नियंत्रण डन और LM8 कोशिकाओं चित्र 1 में दिखाया जाता है. नियंत्रण डन कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ चूहों में, macroscopic और सूक्ष्म metastases गैर perfused और perfused फेफड़ों (चित्रा 1 ए, मैं-IV) में undetectable बने रहे. लेकिन, दिलचस्प, डन - lacZ कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ चूहों में, एक्स - लड़की धुंधला हो एकल कोशिकाओं या गैर perfused फेफड़ों (चित्रा 1 ए, vi) की सतह पर छोटे सेल समूहों (<0.1 मिमी) के नीले micrometastatic foci का पता चला. में सीटू और फेफड़ों के छिड़काव निर्धारण आगे डन lacZ micrometastases (चित्रा 1 ए, viii) की detectability में सुधार. हालांकि, macroscopic foci के लिए परिणाम (चित्रा 1 ए, वी, vii) नहीं मनाया गया./ P>
नियंत्रण LM8 कोशिकाओं, पारदर्शी, बमुश्किल detectable macrometastatic foci इंजेक्शन के साथ चूहों में व्यास में 0.1 मिमी से भी बड़ा गैर perfused फेफड़ों (चित्रा 1B मैं) में पहचाना गया. फेफड़ों के छिड़काव (चित्रा 1B, iii) foci का पता लगाने में सुधार नहीं किया. हालांकि, LM8 lacZ एकाधिक कक्षों के साथ चूहों में इंजेक्शन एक्स लड़की दाग नीले मैक्रो (चित्रा 1B, v) और micrometastases (चित्रा 1B, vi) गैर perfused अंगों की सतह पर पाया गया. इसके अलावा, फेफड़ों के छिड़काव आगे की detectability मैक्रो और micrometastases (viii चित्रा 1B, vii) में सुधार. नतीजतन, सूक्ष्म और macrometastases एक उच्च घनत्व और एक बड़ी संख्या में दिखाई बन गया और इस कारण मुख्य रूप से perfused ऊतक के translucency जिसमें अंग सतह के नीचे foci भी बने दिखाई.
एक अतिरिक्त घंटेफेफड़े के ऊतकों के cryosections का उपयोग कर istological विश्लेषण lacZ transduced डन और LM8 कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ चूहों में फेफड़ों metastases के सुधार detectability की पुष्टि की. प्राथमिक Dunn - lacZ या LM8 lacZ कोशिकाओं से व्युत्पन्न ट्यूमर के साथ चूहों में, संबंधित नियंत्रण कक्ष, micrometastases या यहां तक कि एकल कोशिका foci के प्राथमिक ट्यूमर के साथ चूहों में विपरीत फेफड़ों वर्गों (2 चित्रा) में पहचाना गया. इसके अलावा, macrometastases भी अधिक नियंत्रण LM8 कोशिकाओं (चित्रा -2 सी, डी) के साथ इंजेक्शन पशुओं में से LM8 - lacZ कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ चूहों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे.
चित्रा 1 के सहज metastases के जांच (i-IV) गैर transduced और lacZ transduced (v-viii) (ए) डन और LM8 (बी) में कोशिकाओं (मैं, द्वितीय, वी, vi) गैर perfused और perfused (तृतीय, चतुर्थ, सातवीं, आठवीं) C3H चूहों में फेफड़ों. एक्स - लड़की स्टेशन प्रतिनिधि में metastasesined पूरे (v, ए और बी में सात) फेफड़ों और संबंधित निकट अप (vi, आठवीं में ए और बी) नीले रंग दिखाई देते हैं. (0.1 मिमी) गैर - टैग LM8 कोशिकाओं (बी में मैं-IV) के इंजेक्शन के साथ चूहों के अंगों में Macrometastatic foci तारों से संकेत कर रहे हैं. पास अप में दिखाया क्षेत्रों पूरे फेफड़ों के लिए प्रतिनिधि हैं. स्केल सलाखों के पूरे फेफड़ों के चित्र में 1 मिमी और निकट अप में 0.1 मिमी से संकेत मिलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2 डन और फेफड़ों cryosections में LM8 micrometastases की जांच. अक्टूबर एम्बेडेड फेफड़े के ऊतकों की धारा 37 डिग्री सेल्सियस पर एक्स - लड़की धुंधला हो जाना समाधान में incubated रहे थे एक humidified कक्ष में 24 घंटे के लिए और फिर परमाणु तेजी से लाल के साथ counterstained. तीर (बी) डन lacZ या LM8 - lacZ कोशिकाओं (डी) के साथ इंजेक्शन चूहों के फेफड़ों वर्गों में मान्यता प्राप्त micrometastatic foci इंगित. एमगैर transduced (A) डन या LM8 कोशिकाओं (सी) के साथ इंजेक्शन चूहों के फेफड़ों वर्गों में icrometastases undetectable बने रहे. स्केल सलाखों 0.1 मिमी से संकेत मिलता है.
Discussion
Dunn/LM8 माउस ओएस मॉडल में यहाँ प्रस्तुत परिणाम नव स्थापित विधि कि छिड़काव में सीटू / फेफड़े के ऊतकों के निर्धारण के साथ lacZ टैग ट्यूमर कोशिकाओं के एक्स - लड़की धुंधला हो को जोड़ती की शक्ति को प्रदर्शित करता है. दो तकनीकों का यह संयोजन micrometastatic घावों की उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के एकल कोशिका के स्तर को नीचे की अनुमति देता है और भी फेफड़ों सतह (चित्रा 1) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फेफड़ों के वर्गों में (2 चित्रा) पर macrometastases दृश्य में सुधार. जबकि धुंधला हो एक्स - लड़की भी रक्त और ऊतक से संबंधित प्राकृतिक रंग की वजह से अन्य अंगों में सीटू छिड़काव / निर्धारण में metastases (माइक्रो) का पता लगाने की अनुमति देता है फेफड़ों के अलावा अन्य ऊतकों में metastatic foci के detectability केवल थोड़ा में सुधार इन 13 अंगों की. यहां तक कि अगर छिड़काव अन्य अंगों को निर्देश दिया है, जिगर जैसे, खून की केवल आंशिक रूप से हटाने के विपरीत शर्त में सुधार होगासमझना एक्स लड़की धुंधला हो जाना और अंग के प्राकृतिक रंग. हालांकि, विधि lacZ टैग ट्यूमर कोशिकाओं के किसी भी प्रकार के लिए लागू होता है, नाटकीय रूप से फेफड़ों मेटास्टेसिस के detectability में सुधार नीचे निष्क्रिय एकल कोशिका micrometastases के स्तर और मैक्रो और micrometastases के एक आसान और विश्वसनीय मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है. इस विधि और सभी अन्य तकनीकों कि luciferase और फ्लोरोसेंट प्रोटीन सहित रिपोर्टर जीन, के आधार पर कर रहे हैं की एक सीमा transgene अभिव्यक्ति की स्थिरता है. जैसा कि चित्र 2d में दिखाया है, macrometastatic foci के भीतर ट्यूमर नहीं सभी कोशिकाओं नीले दाग रहे हैं, बीटा galactosidase गतिविधि की एक कमी का संकेत है. यह परिगलन से संबंधित हो सकता है, लेकिन यह अधिक संभावना है transgene अभिव्यक्ति का एक नुकसान के कारण है. हमने पाया है कि डन और LM8 कोशिकाओं लगातार चयन के तहत भी lacZ और अन्य transgenes की अभिव्यक्ति के लिए नीचे विनियमन में बहुत प्रभावी रहे हैं. इसलिए हम हाल ही के अध्ययन में murine K12 बंदऔर K7M2 और मानव अस्पताल 143B, और SaOS-2 ऑस्टियो सार्कोमा सेल लाइनों, जो सभी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय पर 100% करने के लिए vivo में इन विट्रो में स्थिर lacZ अभिव्यक्ति बनाए रखा.
एक बार स्थिर lacZ अभिव्यक्ति की गारंटी है, इस तकनीक जीन चालाकी से ट्यूमर कोशिकाओं, mechanistically ऊतक 13 उपनिवेश की स्थापना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकास और नए उपचारों का परीक्षण metastatic 15 घावों के उन्मूलन में लक्ष्य के लिए करने की प्रक्रिया की जांच करने के लिए जैसे के साथ पढ़ाई में लागू किया जा सकता है 16. इसके अलावा, यह पीईटी, सीटी (माइक्रो) और एमआरआई जैसे वर्तमान रेडियोलॉजिकल इमेजिंग तकनीक, metastatic घावों का जल्दी पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता के सुधार के लिए एक बेंचमार्क के रूप में सेवा कर सकते हैं. हम अलग tracers के साथ हाल ही में एक पीईटी अध्ययन (अप्रकाशित) में सत्यापित vivo का पता चला फेफड़ों में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ बाद में पूर्व vivo metastases. (SkyScan) एक नए छोटे पशु सूक्ष्म सीटी के साथ चल रहे एक अध्ययन में हम इतनी दूर कर रहे हैं अबvivo में ले फेफड़ों metastases का पता लगाने के लिए नीचे 0.5 मिमी और पूर्व vivo 0.3 मिमी के लिए नीचे के आकार के लिए, लेकिन हम 0.1 मिमी के एक प्रस्ताव पर करना है. दिलचस्प है, यह आकार की सीमा है कि हम में सीटू छिड़काव और धुंधला हो एक्स - लड़की के संयुक्त विधि के साथ micrometastases मैक्रो से अलग करने के लिए सेट है. यह फिर से और यह आसान और लागत प्रभावी तकनीक की संवेदनशीलता उपयोगिता को रेखांकित करता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उनकी सलाह के लिए फेफड़ों के छिड़काव की तकनीक पर डॉ. Lubor Borsig (फिजियोलॉजी संस्थान, विश्वविद्यालय के ज्यूरिख) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. यह काम Kanton ज्यूरिख के Krebsliga, वाल्टर एल और जोहन्ना भेड़िया फाउंडेशन, ज्यूरिख, लिडा Hochstrasser फाउंडेशन, ज्यूरिख, स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, एसएनएफ, स्विट्जरलैंड, Schweizerischer Verein Balgrist, और विश्वविद्यालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ज्यूरिख के.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
| Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
| Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
| Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
| Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
| Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
| PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
| SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
| Nuclear-Fast Red - Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
| Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 | |
Table 1. Reagents and Equipment. |
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References
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