Summary
I patogenesen av benmetastas är angiogenes en viktig process och därför representerar ett mål för avbildning och terapi. Här presenterar vi en råtta modell av platsspecifika bröstcancer skelettmetastaser och beskriva strategier för att icke-invasivt bilden angiogenes
Abstract
Angiogenes är ett viktigt särdrag av cancertillväxt och metastasbildning. I benmetastas, angiogena faktorer är avgörande för tumör-cellproliferation i benmärgen kaviteten och för interaktion av tumörceller och benceller resulterar i lokal benförstöring. Vårt mål var att utveckla en modell för experimentell skelettmetastaser som tillåter in vivo utvärdering av angiogenes i skelett lesioner med icke-invasiva avbildningstekniker.
För detta ändamål injicerade vi 10 5 MDA-MB-231 humana bröstcancerceller in i ytliga epigastrisk artär, vilket utesluter tillväxten av metastaser i kroppen andra områden än respektive bakbenet 1. Efter 25-30 dagar efter tumörcellsympning, platsspecifika skelettmetastaser utveckla begränsad till distala femur, proximal tibia och proximal vadben 1. Morfologiska och funktionella aspekter av angiogenes kan undersökas longitudinellt i ben metastases med magnetisk resonanstomografi (MRT), volymetrisk datortomografi (VCT) och ultraljud (US).
MRT visar morfologiska information om den mjuka vävnaden delen av skelettmetastaser som initialt är begränsade till benmärgen kaviteten och därefter överskrider kortikala benet och samtidigt utvecklas. Med dynamisk kontrast-MRT (DCE-MRI) funktionella uppgifter, inklusive regional blodvolym, perfusion och kärlpermeabilitet kan erhållas och kvantifieras 2-4. Benförstöring fångas i hög upplösning genom morfologisk VCT avbildning. Som komplement till MRT-fynd, kan osteolytiska lesioner placeras intill platser för intramedullär tumörtillväxt. Efter kontrastmedel ansökan avslöjar VCT angiografi av macrovessel arkitekturen i skelettmetastaser i hög upplösning och DCE-VCT gör inblick i mikrocirkulationen av dessa skador 5,6. USA är tillämpligt att bedöma morfologiska och funktionella drag från skelettet lesioner på grund avlokal osteolys av kortikalt ben. Använda B-läge och Doppler teknik kan struktur och perfusion av mjukdelar metastaser utvärderas, respektive. DCE-SE möjliggör realtid avbildning av vaskularisering av skelettmetastaser efter injektion av mikrobubblor 7.
Sammanfattningsvis, i en modell av platsspecifik bröstcancer skelettmetastaser multimodala avbildningstekniker, inklusive MRI, VCT och USA erbjuder kompletterande information om morfologi och funktionella parametrar för angiogenes i dessa skelettet lesioner.
Protocol
1. Cellodling
- Kultur MDA-MB-231 humana bröstcancerceller (American Type Culture Collection) i RPMI-1640 (Invitrogen, Tyskland) kompletterat med 10% FCS (Sigma, Tyskland). Håll alla kulturer under normala förhållanden (37 ° C, fuktad atmosfär, 5% CO 2) och passage cellerna 2-3 gånger i veckan för att hålla dem i logaritmisk tillväxt. För djurmodellen beskriven nedan, finns det inget behov för användning av ben-specifika sublinjer av MDA-MB-231-celler som tumören rullningen hastigheten är över 90% 1.
- Skörd subkonfluenta tumörceller efter användning av 2 mM EDTA i PBS-(fosfatbuffrad saltlösning utan Ca 2 + och Mg 2 +) och 0,25% trypsin (Sigma, Taufkirchen, Tyskland). Count MDA-MB-231-celler i en Neubauer-kammaren och suspendera dem i RPMI-1640 (5x10 5 celler i 1 ml).
2. Nude Rat Model of benmetastaser
- Alla experiment har godkänts av det ansvariga statliga AnimaL etisk kommitté.
- Använd nakna råttor i en ålder av 6-8 veckor och förvara dem i patogenfria förhållanden i ett lämpligt litet djur systemet (t.ex. mini-barriär system). Hålla djuren under kontrollerade förhållanden (21 + / - 2 ° C rumstemperatur, 60% luftfuktighet och 12 h ljus-mörker rytm) och erbjuder autoklaverat foder och vatten ad libitum till råttorna.
- Innan djur operation injicera ett smärtstillande läkemedel (t.ex. Karprofen 4 mg / kg sc, på grund av sin enda förvaltning och kort halveringstid (ca 8 h), bör karprofen inte påverka tumörtillväxt). Bedöva råttor med en blandning av syre (0,5 l / min) och isofluran (1-1,5 vol.%) Och se till att råttan är sövd ordentligt och andas regelbundet innan följande procedur.
- Placera sövd djuret under en lämplig binokulärt operationsmikroskop (t.ex. Leica) och arbeta med en förstoring av 16-faldig.
- Börja det kirurgiska ingreppet genom att skära hud och subkutan vävnad i ingunalet region vid en längd av 2-3 cm med sax (BC060r Iris sax 108 mm). Alla artärer förgrenar från lårbensartären (FA) måste dissekeras inklusive ytliga epigastrisk artär (SEA), fallande genicular artär (DGA), knävecksartären (PA) och vena artär (SA).
- Sätt klipp på femoralartären proximala av SMB: s ursprung och på DGA, till PA och SA täppa temporärt lokalt blodflöde. Ligera SEA vid dess bortre del för att möjliggöra öppnandet av detta fartyg utan blödning (Figur 1A).
- Skär SEA med sax (Vannas Micro-SCRS-Räfflad STR 85 mm) proximalt av ligering (Figur 1b) och administrera en 1% papaverin lösning på havet, för att underlätta den efterföljande införandet av en nål på grund av avslappning av fartyget ( Figur 1C).
- Klipp ungefär hälften av SEA diameter med sax och lägg en nål (0,3 mm diameter och 42 mm längd) i lumen havet medan stenkolstjärang cut-slutet av kärlet med en pincett (Figur 1D, E). När de är tillgängliga, fixera nålen i en extern enhet för att minska oregelbundna rörelser som kan leda till perforering av kärlväggen. Ansluta en injektionsspruta till nålen. Ta bort klippet från distala FA och placera den på ytlig artär (Figur 1F).
- Injicera MDA-MB-231-celler suspenderade i 0,2 ml medium långsamt ner i havet. På grund av klämmorna MDA-MB-231-celler är riktade till den DGA och PA. Ta bort nålen och ligera SMB för att förebygga blödning innan av artären klippen. Stäng såret med kirurgiska clips och avsluta inhalationsanestesi.
- För post-förfarandet för övervakning är råttorna oftast avlivades 7-8 veckor efter tumörcellsympning att undvika allvarliga skelett komplikationer. Under denna tid bör djuren övervakas dagligen för att bedöma tumörens storlek och tecken på smärta (t.ex. beteendemässiga avvikelser, viktminskning, motor defekter). Om djur visar en tumörStorleken överskrider etiskt tillåtna gränsen eller bevis på smärta under tumörtillväxt, måste de avlivas.
- Immuno-deficienta (naken) råttor användes för xenogenous transplantation av humana MDA-MB-231 bröstcancerceller. Nakna råttor valdes inte för att bättre visualisera den växande tumören.
3. Magnetisk resonanstomografi (MRT)
- Efter tumörcellsympning låta ungefär 25-30 dagar efter tumörtillväxt innan med avbildning. För MR använda en dedikerad experimentell scanner eller en människa MR system med ett lämpligt djur spole. Vi använde en mänsklig MR-system (Symphony, Siemens, Tyskland) och en hem-inbyggd slinga för radiofrekvent excitation och detektion, utformad som en cylindrisk volym resonator med en inre diameter på 83 mm och en användbar längd på 120 mm (figur 2A).
- Bedöva råtta med syre och isofluran som ges ovan. Placera en kateter i svansvenen och sätt den på svansen med användning av en kran e. Ansluta en spruta innehållande kontrastmedlet (t.ex. 0,1 mmol / kg Gd-DTPA i cirka 0,5 ml, Magnevist, Bayer-Schering, Tyskland).
- Placera råttan i MR-systemet upprätthålla inhalationsanestesi. Börja med en morfologisk MR-sekvens för att lokalisera skelettmetastaser (t.ex. T2 viktade: Turbo spinn eko sekvens, TR 3240 ms, TE 81 ms, matris 152 x 256, FOV 90 x 53,4 mm 2, skiva tjocklek 1,5 mm, 3 genomsnitt, skanna tid 3:40 min).
- Bestäm en bit av skelettmetastaser med den största diametern och starta sekvensen för DCE-MRI (t.ex. mättnad återhämtningen turbo blinksekvens, TR 373 ms, TE 1,86 ms, matris 192 x 144, FOV 130 x 97,5 mm 2, skivtjocklek 5 mm, mått 512, medelvärden 1, söktiden 6:55 min). Efter ca 30 sek, börjar att injicera kontrastmedlet under en tidsperiod av 10 sek. Den totala tiden för de ovan nämnda förfarandena för att utföra en MRI-undersökning är ungefär 15-20 min per djur.
- Välja en lämplig CT-systemet, antingen en människa eller ett experimentellt skanner. Här använde vi en prototyp av en platt panel är utrustad volymetrisk beräknade tomograf (figur 2B, volym CT, Siemens, Tyskland).
- Bedöva råtta med syre och isofluran som ges ovan. Placera en kateter i svansvenen och fäst den på svansen med hjälp av en tejp. Ansluta en spruta innehållande kontrastmedlet (t.ex. 1 g jod per kg i ca 0,5 ml, Imeron 400, Bracco, Tyskland).
- Placera råttan på skannern i inhalationsanestesi. Använd följande scan parametrarna för VCT: rörspänning 80 kV, rörström 50 mA, skanning tiden 51 sekunder, rotationshastighet 10 sek, bildrutor per sekund 120, matris 512 x 512 och skivtjocklek 0,2 mm. Injicera kontrastmedlet under den andra rotationen i platta systemet. Den totala tiden för de ovan nämnda förfarandena för att utföra en LCS undersökning är ungefär 5-10 min per Animal.
- Rekonstruera bilder med en modifierad FDK (Feldkamp-Davis-Kress) kon-stråle rekonstruktion algoritm (kärna H80a, Afra, Tyskland).
5. Ultraljud (US)
- Experimentella och kliniska US system är tillgängliga för detta ändamål. Vi använde den kliniska systemet Acuson Sequoia 512 ultraljud system med en 15L8 linjär givare (figur 2C, Siemens-Acuson, Mountain View, CA).
- Bedöva råtta med syre och isofluran som ges ovan. Placera en kateter i svansvenen och fäst den på svansen med hjälp av en tejp. Ansluta en spruta innehållande en mikrobubbla kontrastmedel (t.ex. 1,6 ml / kg i ca 0,5 ml, SonoVue, Bracco, Italien). Fäst den amerikanska givaren på respektive bakbenet använder ett stativ och tillämpa amerikanska gel mellan givaren och bakben.
- Utför B-mode scanning (sändningsfrekvensen: 17 MHz, mekaniskt index: 0,51) för att bestämma den största diameter skelettmetastaser och fixera givaren i tonsin position. Lägg Doppler signal på B-mode bilder för information om vävnadsperfusion. Tänk på att endast skador som stör kortikalben är tillgängliga för amerikanska vågor.
- För dynamisk kontrastförstärkt US (DCE-US) som den amerikanska enheten i kadens däremot puls sekvensering (CPS) läge (sändningsfrekvensen: 7 MHz, mekaniskt index: 0,18), injicera mikrobubblorna och spela en cine loop på 90 sekunder lång. Den totala tiden för de ovan nämnda förfarandena för att utföra en US undersökning är cirka 10-15 minuter per djur.
6. Efterbehandling av bilddata
- Använd morfologiska informationen från MRI, VCT och USA för att karakterisera den mjuka vävnaden tumören (MRI, USA) och skelett förstörelsen (VCT) av skelettmetastaser och bestämma plats, lesionsstorleken och volymen av de lesioner med en DICOM tittare (t.ex. Osirix Dicom Viewer).
- För att erhålla förgrening mönstret av fartyg i skelettmetastaser (angiografi) kan VCT data användas. Reuppföra 2D-eller 3D-bilder med hjälp av information om arteriell fas med eller utan subtraktion tekniker (t.ex. Osirix Dicom Viewer).
- För att kvantifiera parametrar för vaskularisering från DCE-MRI, DCE-VCT och DCE-US använder programverktyg som är specifika för de närmare villkoren. För DCE-MRI, bestämmer vaskulära parametrarna amplituden A (i samband med blodvolym) och växelkurs k ep (i samband med perfusion och kärlpermeabilitet) i skelettmetastaser med Dyna Lab (Mevis Research, Bremen, Tyskland) baserat på två- kompartmentmodell av Brix 8,9. Alternativa farmakokinetiska modeller för utvärdering är tillgängliga, t.ex. Tofts modellen 10.
- För att kvantifiera DCE-VCT data, utföra en deskriptiv analys av data för att beräkna parametrar som area under kurvan (AUC) eller peak förstärkning (PE) med Dyna Lab (Mevis Research, Bremen, Tyskland).
- Kvantifiera information från realtid DCE-oss genom kvantitativ analys programvara (t.ex. Qontrast, Bracco, Italien) genom att analysera Cine-bågar enligt genomfört bolusinjektion modell. Placera regionen av intresse (ROI) över benmetastas bestämma antingen beskrivande faktorer såsom området under kurvan eller kvantitativa parametrar från färgkodade kartor, t.ex. regionalt blodvolym, regional blodflöde och fyllning tid.
7. Representativa resultat
Efter intraarteriell injektion av MDA-MB-231 celler till havet (Figur 1), platsspecifika skelettmetastaser utvecklas i respektive bakbenet av nakna råttan. Osteolytiska lesioner begränsade till lårbenet, kan skenben och vadben avbildas icke-invasivt med MRI, VCT och USA (figur 2) med början cirka 25-30 dagar efter injektion och följdes upp under flera veckor. Vid kombination MRI, VCT och USA, inklusive infödda och kontrast-förbättrade tekniker kan kompletterande information bedömas i skelettmetastaser som består av en mjuk vävnadtumör (tumörceller och stroma) och respektive osteolytiska lesioner (benförstöring). För jämförelse av de respektive data mellan de tekniker, kan alla tre bildanalysmodaliteter användas sekventiellt i samma råtta. MRT visar morfologi ben metastaserande mjuka vävnaden som inledningsvis är begränsat till benmärgen kaviteten och därefter än kortikalt ben under utveckling. Funktionella parametrar, såsom regionala blodvolym, perfusion och kärlpermeabilitet kan erhållas från DCE-MRI kvantifieras och (Figur 3). Benstomme, särskilt osteolytiska förändringar i metastaser bedöms i hög upplösning med VCT. Som komplement till MRT-fynd, är osteolytiska lesioner ligger intill den intramedullära tumörtillväxt. VCT angiografi visar den förändrade macrovessel arkitektur skelettmetastaser och DCE-VCT visar respektive delar av mikrocirkulationen (Figur 4). På grund av lokal destruktion av kortikalt ben i metastatic lesioner, är US tillämplig för att bedöma morfologiska och funktionella egenskaper hos den mjuka vävnaden tumören genom användning av B-mode och Doppler-tekniker. Vid tillämpning av mikrobubblor, tillåter DCE-US i realtid avbildning av vaskularisering i skelettmetastaser (Figur 5).
Figur 1. Bakben en naken råtta förberedd för tumörcellsympning som avbildas genom en operation mikroskop. A, förgrening mönster lårbensartären (FA) inklusive ytliga epigastrisk artär (SEA), fallande genicular artär (DGA), knävecksartären (PA) och vena artär (SA). Arteriella klipp placeras på SA, PA och proximal FA samt ligering av SEA, B, SEA skars proximalt lige, C, muskelavslappning i SMB efter tillsättning av papaverin, D, incision av SEA (tas upp av en pincett), E, införande av nålen i SEA, F, fixerad nål i havet (extern fi xating enheten) och injektion av MDA-MB-231 tumörceller via havet in i DGA och PA grund av klippen.
Figur 2 A, humant MR system (Symphony, Siemens, Tyskland) och en hem-inbyggd slinga för radiofrekvent excitation och detektering placeras i skannern;. B, platt utrustade volymetrisk beräknade tomograf (volym CT, Siemens, Tyskland), C, kliniska ultraljudssystemet Acuson Sequioa 512 (Siemens-Acuson, Mountain View, CA).
Figur 3. Axiella MR sektioner. Vänster panel, T2W MRI, mellersta panelen amplituden A (DCE-MRI), höger panel, växelkurs k EP (DCE-MRI). Pilar pekar på skelettmetastaser. Färgen kartan för DCE-MRI data som sträcker sig från röd (höga värden) till blå (låga värden).
78/4178fig4.jpg "/>
Figur 4. 3D VCT rekonstruktioner av osteolytiska benmetastaser (vänster fält) och en angiografi (mellersta fältet) och en DCE-VCT sektion i axiell riktning från den parameter topp förstärkning (höger panel). Färgen kartan för DCE-VCT uppgifter varierar från röd (höga värden) till blå (låga värden).
Figur 5. Amerikanska bilder från B-mode (morfologi, vänstra panelen), Doppler (perfusion, mitten panel) och CEUS (höger panel, topp förstärkning efter injektion av mikrobubblor från i realtid avbildning av vaskularisering) av ett ben metastaser.
Kompletterande film 1. Klicka här för att se extra film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod för att inducera experimentell benmetastaser presenteras här i kombination med de bildgivande förfaranden möjliggör att följa upp osteolytiska lesioner i nakna råttor längdriktningen. I vår modell är MDA-MB-231 humana bröstcancerceller injiceras i SEA, som är en anastomos mellan höftartären via den pudendoepigastric stammen och den femorala artären. Följaktligen är blodflödet till den medföljande regionen av knäleden bibehålls efter ligering av SEA. Fördelarna med denna modell jämfört med etablerade modeller av benmetastas är den platsspecifika utseende av benmetastaser jämfört med injektion i hjärtat modell 11 och införlivandet av de patogena processerna tumörcell extravasation och migrering till målvävnaden jämfört med skenbenet injektionen modellen 12. Vidare i denna modell en systemisk tumörbörda, i synnerhet visceral spridning, utelämnas vilket möjliggör longitudinella studier över sigFörberedande arbe veckor och därmed gör det möjligt att minskningen av erforderliga djur 1,13.
Rollen för angiogenes som väsentliga processen för att främja proliferation av tumörceller och inducera benresorption i patogenesen av benmetastas visades tidigare i ex vivo-studier 14,15. Här presenterar vi in vivo imaging tekniker för att icke-invasivt bedöma angiogenes i dessa lesioner som gäller MRT, VCT och USA. Med hjälp av en naken råttmodell, kompletterande information om vaskularisering, inklusive funktionell information om blodvolym och kärlpermeabilitet / perfusion (DCE-MRI, DCE-VCT), fartyg morfologi i hög upplösning (VCT angiografi), perfusion (US Doppler) och real-tid avbildning av vaskularisering (DCE-US) kan erhållas 1-7,16.
Avbildning av angiogena parametrar med MRI, VCT och USA gör det möjligt att klarlägga patogen roll av angiogenes i skelettet metastaser icke-invasivt och in vivo 3,4,6. En annan tillämpning för de ovan nämnda avbildningstekniker är undersökningen av terapeutiska effekter i longitudinella studier på anti-angiogena eller standard terapier för skelettmetastaser. För demonstration av farmakologisk respons, longitudinella studier som täcker upp till 70 dagar efter tumörcellen inokulering med gruppstorlekar mellan 8 och 17 råttor för att utröna anti-tumör, anti-angiogena och antiresorptivt effekter 2-7,17. Till följd av tillämpningen av radiologiska metoder på scanners för humant bruk inom ett kliniskt relevant djurmodell, som presenteras förfaranden är av hög translationell värde för bedömning av behandling hos patienter med skelettmetastaser 16.
Sammanfattningsvis kan använda denna sätesspecifik djurmodell av ben bröstcancerceller metastaser, morfologiska och funktionella aspekter av angiogenes skall avbildas icke-invasivt och in vivo
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB-TR 23 och SFB-TR 79, tuberkulos och Danmark). Författarna vill tacka Renate Bangert, Karin Leotta och Lisa Seyler utmärkt tekniskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 human breast cancer cells | American Type Culture Collection | HTB-26 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 61870 | |
| FCS | Invitrogen | 10270 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300 | |
| Carprofen Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | PZN 110208 | |
| Magnevist | Bayer-Schering | PZN 6961516 | |
| Imeron 400 MCT | Bracco | PZN 228654 | |
| SonoVue | Bracco | PZN 1567358 | |
| Papaverin | Alfa Aesar | L 04152 | |
| Isofluran | Baxter Internationl Inc. | HDG 9623 | |
| Symphony (Magnetic resonance imaging) | Siemens AG | ||
| Volume CT (Volumetric computed tomography) | Siemens AG | ||
| Acuson Sequioa 512 (Ultrasound) | Siemens-Acuson |
References
- Bäuerle, T. Characterization of a rat model with site-specific bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells and its application to the effects of an antibody against bone sialoprotein. Int. J. Cancer. 115, 177-186 (2005).
- Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W., Bäuerle, T. Sorafenib tosylate and paclitaxel induce anti-angiogenic, anti-tumor and anti-resorptive effects in experimental breast cancer bone metastases. Eur. J. Cancer. 47, 277-286 (2010).
- Bäuerle, T. Cilengitide inhibits progression of experimental breast cancer bone metastases as imaged noninvasively using VCT, MRI and DCE-MRI in a longitudinal in vivo study. Int. J. Cancer. 128, 2453-2462 (2011).
- Bäuerle, T., Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W. Drug-induced vessel remodeling in bone metastases as assessed by dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging and vessel size imaging: a longitudinal in vivo study. Clin. Cancer Res. 16, 3215-3225 (2010).
- Bäuerle, T. Imaging anti-angiogenic treatment response with DCE-VCT, DCE-MRI and DWI in an animal model of breast cancer bone metastasis. Eur. J. Radiol. 73, 280-287 (2010).
- Bäuerle, T. Bevacizumab inhibits breast cancer-induced osteolysis, surrounding soft tissue metastasis, and angiogenesis in rats as visualized by VCT and MRI. Neoplasia. 10, 511-520 (2008).
- Merz, M., Komljenovic, D., Semmler, W., Bäuerle, T. Quantitative contrast-enhanced ultrasound for imaging anti-angiogenic treatment response in experimental osteolytic breast cancer bone metastases. , Forthcoming (2012).
- Brix, G. Pharmacokinetic parameters in CNS Gd-DTPA enhanced MR imaging. J. Comput. Assist. Tomogr. 15, 621-628 (1991).
- Brix, G. Microcirculation and microvasculature in breast tumors: pharmacokinetic analysis of dynamic MR image series. Magn. Reson. Med. 52, 420-429 (2004).
- Tofts, P. S. Estimating kinetic parameters from dynamic contrast-enhanced T(1)-weighted MRI of a diffusable tracer: standardized quantities and symbols. J. Magn. Reson. Imaging. 10, 223-232 (1999).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48, 6876-6881 (1988).
- Kjonniksen, I., Winderen, M., Bruland, O., Fodstad, O. Validity and usefulness of human tumor models established by intratibial cell inoculation in nude rats. Cancer Res. 54, 1715-1719 (1994).
- Bäuerle, T. Treatment of bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells with an antibody against bone sialoprotein. Int. J. Oncol. 28, 573-583 (2006).
- Andersen, T. L. A physical mechanism for coupling bone resorption and formation in adult human bone. Am. J. Pathol. 174, 239-247 (2009).
- Nyangoga, H., Mercier, P., Libouban, H., Basle, M. F., Chappard, D. Three-dimensional characterization of the vascular bed in bone metastasis of the rat by microcomputed tomography (MicroCT). PLoS One. 6, e17336 (2011).
- Bäuerle, T., Semmler, W. Imaging response to systemic therapy for bone metastases. European Radiol. 19, 2495-2507 (2009).
- Bretschi, M. Cilengitide inhibits metastastic bone colonization in a nude rat model. Oncol. Rep. 26, 843-851 (2001).
