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Medicine

Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

doi: 10.3791/4178 Published: August 14, 2012

Summary

Nella patogenesi di metastasi ossea, l'angiogenesi è un processo fondamentale e rappresenta quindi un bersaglio per l'imaging e la terapia. Qui vi presentiamo un modello di ratto del site-specific metastasi ossee cancro al seno e strategie per descrivere in modo non invasivo l'angiogenesi immagine

Abstract

L'angiogenesi è un elemento essenziale della crescita del tumore e la formazione di metastasi. In metastasi ossee, fattori angiogenici sono fondamentali per la proliferazione delle cellule tumorali nella cavità midollo osseo, nonché per l'interazione delle cellule tumorali e osso con conseguente distruzione ossea locale. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un modello di metastasi ossee sperimentale che permette di valutare in vivo l'angiogenesi nelle lesioni scheletriche con tecniche non invasive di imaging.

Per questo scopo, abbiamo iniettato 10 5 MDA-MB-231 cellule umane di cancro al seno in arteria epigastrica superficiale, che preclude la crescita di metastasi in altre aree del corpo rispetto alla rispettiva gamba posteriore 1. Dopo 25-30 giorni dopo l'inoculazione delle cellule tumorali, site-specific di sviluppare metastasi ossee, limitatamente al femore distale, tibia prossimale e prossimale del perone 1. Aspetti morfologici e funzionali di angiogenesi può essere studiata longitudinalmente in meta osseastasi che utilizzano la risonanza magnetica (MRI), tomografia computerizzata volumetrica (VCT) ed ecografia (US).

MRI mostra le informazioni morfologiche da parte dei tessuti molli delle metastasi ossee che viene inizialmente confinato alla cavità contenente il midollo osseo e supera successivamente l'osso corticale durante la progressione. Utilizzo di contrasto dinamico-enhanced MRI (DCE-MRI) funzionali compresi i dati del volume ematico regionale, la perfusione e permeabilità vasale può essere ottenuto e quantificati 2-4. Distruzione del tessuto osseo viene catturato in alta risoluzione utilizzando l'imaging morfologico VCT. Complementare ai risultati risonanza magnetica, le lesioni osteolitiche possono essere adiacente a siti di crescita del tumore intramidollare. Dopo l'applicazione di contrasto, VCT angiografia rivela l'architettura macrovessel nelle metastasi ossee in alta risoluzione, e DCE-VCT permette di comprendere a livello del microcircolo di queste lesioni 5,6. Degli Stati Uniti è applicabile per valutare le caratteristiche morfologiche e funzionali da lesioni scheletriche a causa diosteolisi locale di osso corticale. Utilizzando B-mode e le tecniche Doppler, la struttura e la perfusione dei tessuti molli metastasi possono essere valutati, rispettivamente. DCE-ci permette in tempo reale immagini di vascolarizzazione in metastasi ossee dopo l'iniezione di microbolle 7.

In conclusione, in un modello di site-specific ossa tumore al seno metastasi multi-modali tra cui tecniche di imaging MRI, VCT offerta degli Stati Uniti e le informazioni complementari sulla morfologia e parametri funzionali di angiogenesi in queste lesioni scheletriche.

Protocol

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1. Coltura cellulare

  1. Culture MDA-MB-231 cellule umane di carcinoma mammario (American Type Culture Collection) in RPMI-1640 (Invitrogen, Germania) supplementato con 10% FCS (Sigma, Germania). Tenere tutte le culture in condizioni standard (37 ° C, atmosfera umidificata, 5% di CO 2) e il passaggio delle cellule 2-3 volte a settimana per tenerli in crescita logaritmica. Per il modello animale descritto di seguito, non vi è alcuna necessità di utilizzo di osso-specifici sottolinee di MDA-MB-231 cellule, come il tasso di ripresa tumore è superiore al 90% 1.
  2. Raccogliere cellule tumorali sub-confluenti dopo utilizzando EDTA 2 mM in PBS-(salina tamponata con fosfato senza Ca 2 + e Mg 2 +) e 0,25% tripsina (Sigma, Taufkirchen, Germania). Conte MDA-MB-231 cellule nella camera A Neubauer e sospenderle in RPMI-1640 (5x10 5 cellule in 1 ml).

2. Rat Modello Nudo di metastasi ossee

  1. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal responsabile anima governatival comitato etico.
  2. Utilizzare ratti nudi ad un'età di 6-8 settimane e tenerli a esenti da organismi patogeni condizioni di un adeguato sistema di piccoli animali (ad esempio mini-barriera di sistema). Tenere gli animali in condizioni controllate (21 + / - 2 ° C temperatura ambiente, 60% di umidità, e 12 ore ritmo luce-buio) e di offrire alimenti autoclavato e ad libitum acqua per i topi.
  3. Prima dell'intervento degli animali, iniettare un farmaco analgesico (ad esempio Carprofen 4 mg / kg sc, grazie alla sua somministrazione singola e breve emivita (circa 8 ore), carprofen non dovrebbe pregiudicare la crescita del tumore). Anestetizzare ratti con una miscela di ossigeno (0,5 l / min) ed isoflurano (1-1,5 vol.%) E assicurarsi che il ratto è anestetizzato respira correttamente e regolarmente prima di iniziare la seguente procedura.
  4. Posizionare l'animale anestetizzato con un microscopio binoculare operativo appropriato (ad esempio Leica) e lavorare con un ingrandimento di 16 volte.
  5. Iniziare la procedura chirurgica tagliando la cute e sottocute nel inguinale regione ad una lunghezza di 2-3 cm con le forbici (BC060r Iris forbici 108 mm). Tutte le arterie si diramano l'arteria femorale (FA) devono essere sezionato tra l'arteria epigastrica superficiale (SEA), l'arteria discendente genicular (DGA), poplitea (PA) e dell'arteria safena (SA).
  6. Mettere clip sulla arteria femorale prossimale dell'origine del mare, nonché sulla DGA, PA e SA per occludere temporaneamente il flusso sanguigno locale. Legare il mare la sua parte distale per consentire l'apertura di questa nave, senza sanguinamento (Figura 1A).
  7. Tagliare la SEA con le forbici (Vännäs Micro-SCRS-scanalato STR 85 mm) prossimali della legatura (Figura 1B) e gestire una soluzione di 1% papaverina sul mare, per facilitare il successivo inserimento di un ago grazie al rilassamento della nave ( Figura 1C).
  8. Tagliare circa la metà del diametro del mare con forbici e inserire un ago (0,3 mm di diametro e lunghezza 42 mm) nel lume del mare mentre Functional coloranting il taglio-end del vaso con una pinza (Figura 1D, E). Quando è disponibile, fissare l'ago in un dispositivo esterno per ridurre i movimenti irregolari che potrebbero causare la perforazione della parete del vaso. Collegare una siringa all'ago. Rimuovere la clip dal FA distale e posizionarlo sul arteria safena (Figura 1F).
  9. Iniettare le MDA-MB-231 cellule sospese in 0,2 ml mezzi lentamente nel mare. In virtù delle clip MDA-MB-231 cellule vengono indirizzati al DGA e PA. Rimuovere l'ago e legare la SEA per prevenire le emorragie prima di togliere le clip delle arterie. Chiudere la ferita con clips chirurgiche e terminare l'anestesia per inalazione.
  10. Per post-procedura di controllo, i ratti vengono sacrificati in genere 7-8 settimane dopo l'inoculazione delle cellule tumorali al fine di evitare gravi complicanze scheletriche. Durante questo tempo, gli animali devono essere monitorati giorno per valutare le dimensioni del tumore e le prove del dolore (ad esempio, deviazioni comportamentali, perdita di peso, difetti del motore). Se gli animali mostrano un tumoredimensione che superi il limite eticamente consentito o evidenza di dolore durante la crescita del tumore, devono essere eutanasia.
  11. Immuno-deficienti (nude), i ratti sono stati utilizzati per i trapianti umani xenogenous di MDA-MB-231 cellule tumorali del seno. Ratti nudi, non sono stati scelti per visualizzare meglio il tumore in crescita.

3. Magnetic Resonance Imaging (MRI)

  1. Dopo l'inoculazione delle cellule tumorali, occorrono circa 25-30 giorni di crescita del tumore prima di iniziare con l'imaging. Per RM utilizzare uno scanner dedicato sperimentale o un sistema umano MR con una bobina appropriati condotti su animali. Abbiamo utilizzato un sistema umano MR (Symphony, Siemens, Germania) e una casa costruita bobina di eccitazione per radiofrequenza e rilevazione, progettato come un volume cilindrico risonatore con un diametro interno di 83 mm e una lunghezza utile di 120 mm (Figura 2A).
  2. Anestetizzare il topo con l'ossigeno e isoflurano come descritto sopra. Posizionare un catetere nella vena della coda e fissarlo sulla coda con un tap e. Collegare una siringa contenente il mezzo di contrasto (per esempio 0,1 mmol / kg Gd-DTPA in circa 0,5 ml; Magnevist, Bayer-Schering, Germania).
  3. Mettere il topo nel sistema MR mantenere l'anestesia per inalazione. Iniziare con una sequenza morfologica MR per individuare le metastasi ossee (ad esempio T2 pesata: sequenza turbo spin echo, TR 3240 ms, TE 81 ms, matrice di 152 x 256, FOV 90 x 53,4 millimetri 2, spessore di strato 1,5 mm, 3 medie, scan tempo di 3:40 min).
  4. Determinare una fetta di metastasi ossee con la più grande diametro e avviare la sequenza per DCE-MRI (ad esempio il recupero di saturazione turbo sequenza di flash, TR 373 ms, TE 1,86 ms, matrice di 192 x 144, FOV 130 x 97,5 mm 2, spessore di strato 5 mm, misure 512, medie 1, tempo di scansione 6:55 min). Dopo circa 30 secondi, inizia a iniettare l'agente di contrasto per un periodo di tempo di 10 sec. Il tempo totale per le suddette procedure per eseguire un esame RMN è di circa 15-20 min per animale.
titolo "> 4. volumetrica Tomografia Computerizzata (VCT)

  1. Scegliere un opportuno sistema CT, sia un essere umano o uno scanner sperimentale. Qui, abbiamo utilizzato un prototipo di schermo piatto dotato tomografo volumetrico computerizzata (Figura 2B; Volume CT, Siemens, Germania).
  2. Anestetizzare il topo con l'ossigeno e isoflurano come descritto sopra. Posizionare un catetere nella vena della coda e fissarlo sulla coda con un nastro. Collegare una siringa contenente il mezzo di contrasto (per esempio 1 g di iodio per kg in circa 0,5 ml; Imeron 400, Bracco, Germania).
  3. Posizionare il ratto sullo scanner sotto anestesia inalatoria. Utilizzare i seguenti parametri di scansione per VCT: tensione del tubo 80 kV, della corrente del tubo 50 mA, tempo di scansione 51 sec, velocità di rotazione 10 sec, 120 fotogrammi al secondo, matrice 512 x 512 e spessore di strato 0,2 mm. Iniettare l'agente di contrasto durante la seconda rotazione del sistema di flat panel. Il tempo totale per le suddette procedure per eseguire un esame VCT è circa 5-10 min per animal.
  4. Ricostruzione delle immagini con un FDK modificato (Feldkamp-Davis-Kress) cone-beam algoritmo di ricostruzione (kernel H80a, Afra, Germania).

5. Ultrasound (US)

  1. Sperimentali e clinici, i sistemi degli Stati Uniti sono disponibili a questo scopo. Abbiamo usato il sistema clinico Acuson Sequoia 512 sistema a ultrasuoni con un trasduttore 15L8 lineare (figura 2C, Siemens-Acuson, Mountain View, CA).
  2. Anestetizzare il topo con l'ossigeno e isoflurano come descritto sopra. Posizionare un catetere nella vena della coda e fissarlo sulla coda con un nastro. Collegare una siringa contenente un agente microbolle di contrasto (ad esempio 1,6 ml / kg in circa 0,5 ml; SonoVue, Bracco, Italia). Fissare il trasduttore Stati Uniti sulla rispettiva gamba posteriore si utilizza un treppiede e di applicare il gel degli Stati Uniti tra il trasduttore e la gamba posteriore.
  3. Eseguire B-mode (frequenza di trasmissione: 17 MHz; indice meccanico: 0,51) per determinare il diametro maggiore della metastasi ossea e fissare il trasduttore in tla sua posizione. Aggiungi il segnale Doppler B-mode immagini per maggiori informazioni sulla perfusione tissutale. Si prega di tenere presente che solo le lesioni che distruggono l'osso corticale sono accessibili alle onde degli Stati Uniti.
  4. Per dinamica ecocontrastografia (DCE-US), impostare il dispositivo di contrasto degli Stati Uniti in cadenza di impulsi sequencing (CPS) modalità (frequenza di trasmissione: 7 MHz; indice meccanico: 0,18), iniettare le microbolle e registrare un cine loop di lunghezza di 90 sec. Il tempo totale per le suddette procedure per eseguire un esame ecografico è di circa 10-15 minuti per ogni animale.

6. Postprocessing dei dati di imaging

  1. Utilizzare le informazioni morfologiche da MRI, VCT e gli Stati Uniti per caratterizzare il tumore dei tessuti molli (MRI, USA) e la distruzione dello scheletro (VCT) di metastasi ossee e di determinare la posizione, dimensione della lesione e il volume delle lesioni con un visualizzatore DICOM (ad esempio OsiriX Dicom Viewer).
  2. Per ottenere il tipo di ramificazione dei vasi in metastasi ossee (angiografia), i dati VCT possono essere utilizzati. Recostruire immagini 2D o 3D utilizzando le informazioni della fase arteriosa, con o senza tecniche di sottrazione (es. OsiriX Dicom Viewer).
  3. Al fine di quantificare i parametri di vascolarizzazione da DCE-MRI, DCE-VCT e DCE-US, utilizzare gli strumenti software specifici per le modalità. Per DCE-MRI, determinare la vascolare parametri di ampiezza A (associato con volume di sangue) e il tasso di cambio costante k ep (associato a perfusione e permeabilità vasale) in metastasi ossee con Dyna Lab (Mevis Research, Brema, Germania) in base a due modello compartimentale di 8,9 Brix. Alternativi modelli farmacocinetici di valutazione sono disponibili, ad esempio il modello Tofts 10.
  4. Per quantificare DCE-VCT di dati, eseguire una analisi descrittiva dei dati per calcolare i parametri come area sotto la curva (AUC) o di aumento del picco (PE) con Dyna Lab (Mevis Research, Brema, Germania).
  5. Quantificare le informazioni in tempo reale DCE-US utilizzando il software di analisi quantitativa (ad esempio Qontrast, Bracco, Italia) analizzando cine-anelli secondo il modello bolo implementato iniezione. Posizionare la regione di interesse (ROI) sul metastasi ossee, determinare i fattori sia descrittivi come area sotto la curva o parametri quantitativi da colori diversi, ad esempio mappe del volume sanguigno regionale, il flusso sanguigno regionale e il tempo di riempimento.

7. Risultati rappresentativi

Dopo l'iniezione intrarteriosa di MDA-MB-231 cellule in mare (figura 1), sito-specifici metastasi ossee sviluppano nella rispettiva gamba posteriore del ratto nudo. Lesioni osteolitiche confinati al femore, tibia e perone possono essere esposte in modo non invasivo con MRI, VCT e degli Stati Uniti (Figura 2) a partire circa 25-30 giorni dopo l'iniezione e follow-up per diverse settimane. Quando si combinano MRI, VCT e Stati Uniti compresi nativa e contrasto avanzate tecniche, informazioni complementari possono essere valutati in metastasi ossee che sono composte da un tessuto molletumore (le cellule tumorali e stroma) e la lesione osteolitica rispettiva (distruzione ossea). Per confronto dei dati tra i rispettivi tecniche, tutte e tre le modalità di imaging possono essere utilizzati in modo sequenziale nel ratto stesso. MRI mostra morfologia del tessuto osseo metastatico morbido che è inizialmente limitata alla cavità midollo osseo e supera successivamente osso corticale in corso di sviluppo. Parametri funzionali quali regionale volume di sangue, perfusione e permeabilità vasale può essere ottenuto da DCE-MRI e quantificato (Figura 3). Struttura ossea, e in particolare i cambiamenti osteolitiche delle metastasi sono valutati in alta risoluzione da VCT. Complementare ai risultati risonanza magnetica, le lesioni osteolitiche si trova adiacente al intramidollare la crescita tumorale. VCT angiografia rivela l'architettura alterata macrovessel di metastasi ossee, e DCE-VCT mostra rispettivi aspetti del microcircolo (Figura 4). A causa della distruzione locale dell'osso corticale in metastatilesioni c, US è applicabile per valutare le caratteristiche morfologiche e funzionali del tumore dei tessuti molli mediante l'uso di B-mode e tecniche Doppler. Su richiesta delle microbolle, DCE-ci permette in tempo reale immagini di vascolarizzazione nelle metastasi ossee (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Zampa posteriore di un topo nudo preparata per l'inoculazione delle cellule tumorali, come ripreso attraverso un microscopio operazione. A, modello di ramificazione dell'arteria femorale (FA), compresa l'arteria epigastrica superficiale (SEA), l'arteria discendente genicular (DGA), poplitea (PA) e dell'arteria safena (SA). Clip arteriosi immessi sul SA, PA e FA prossimale così come la legatura di mare; B, SEA è stato tagliato prossimale della legatura, C, rilassamento muscolare della VAS dopo l'aggiunta di papaverina, D, incisione del SEA (ripreso da una pinza); E, l'inserimento dell'ago in SEA, F, l'ago fissato nel mare (esterno fi xating dispositivo) e l'iniezione di MDA-MB-231 cellule tumorali attraverso la VAS nel DGA e PA in virtù delle clip.

Figura 2
Figura 2 A, umana MR sistema (Symphony, Siemens, Germania) e una casa costruita bobina di radiofrequenza per l'eccitazione e la rilevazione nello scanner;. B, a schermo piatto dotato tomografo volumetrico computerizzata (CT Volume, Siemens, Germania); C, ecografia clinica del sistema Acuson Sequioa 512 (Siemens-Acuson, Mountain View, CA).

Figura 3
Figura 3. Sezioni assiali MR. Pannello di sinistra, T2w RM; pannello centrale, di ampiezza A (DCE-MRI), pannello di destra, il tasso di cambio costante k ep (DCE-MRI). Le frecce indicano le metastasi ossee. La mappa a colori per DCE-MRI intervalli di dati dal rosso (valori elevati) a blu (valori bassi).

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Figura 4. Ricostruzioni VCT 3D della metastasi osteolitiche (pannello sinistro) e una angiografia (pannello centrale) e un DCE-VCT sezione orientamento assiale dal parametro di aumento del picco (pannello destro). La mappa a colori per DCE-VCT intervalli di dati dal rosso (valori elevati) a blu (valori bassi).

Figura 5
Figura 5. Immagini ecografiche da B-mode (morfologia, pannello di sinistra), Doppler (perfusione, pannello centrale) e CEUS (pannello di destra, di aumento del picco dopo l'iniezione di microbolle di imaging in tempo reale della vascolarizzazione) di una metastasi ossee.

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Discussion

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Il metodo per indurre metastasi ossea sperimentale qui presentato in combinazione con le procedure di imaging permettono di follow-up lesioni osteolitiche in ratti nudi longitudinalmente. Nel nostro modello, MDA-MB-231 cellule umane di cancro al seno sono iniettati nel mare che è una anastomosi tra l'arteria iliaca attraverso il tronco pudendoepigastric e l'arteria femorale. Di conseguenza, il flusso di sangue nella regione fornito dell'articolazione del ginocchio è mantenuta dopo la legatura del SEA. I vantaggi di questo modello rispetto ai modelli stabiliti di metastasi ossee sono il sito-specifica comparsa di metastasi ossee rispetto al modello di iniezione intracardiaca 11 e l'inserimento dei processi patogeni di stravaso delle cellule tumorali e la migrazione al tessuto bersaglio rispetto ai il modello iniezione tibia 12. Inoltre, in questo modello massa tumorale sistemica, in particolare diffusione viscerale, viene omesso che consente studi longitudinali oltre séOffice per più settimane, e quindi permette la riduzione degli animali richiesti 1,13.

Il ruolo di angiogenesi come processo essenziale per promuovere la proliferazione delle cellule tumorali e indurre il riassorbimento osseo nella patogenesi di metastasi ossee è stato precedentemente dimostrato in studi ex vivo 14,15. Qui, presentiamo in tecniche di imaging in vivo per valutare in maniera non invasiva l'angiogenesi in queste lesioni si applicano MRI, VCT e Stati Uniti. Utilizzando un modello di ratto nudo informazioni complementari, comprese le informazioni di vascolarizzazione funzionale dal volume ematico e vaso di permeabilità / perfusione (DCE-MRI, DCE-VCT), morfologia nave in alta risoluzione (VCT angiografia), perfusione (US Doppler) e in tempo reale imaging di vascolarizzazione (DCE-US) possono essere ottenuti 1-7,16.

Imaging dei parametri angiogenetici mediante MRI, VCT e gli Stati Uniti consente di chiarire il ruolo patogenetico della angiogenesi in metastasi scheletriche non-invasiva e in vivo 3,4,6. Un'altra applicazione delle suddette tecniche di imaging è l'indagine degli effetti terapeutici in studi longitudinali su terapie anti-angiogenici o standard per le metastasi scheletriche. Per la dimostrazione di risposta farmacologica, studi longitudinali che copre fino a 70 giorni dopo l'inoculazione delle cellule tumorali, con gruppi di dimensioni comprese tra 8 e 17 ratti sono stati effettuati per dimostrare anti-tumorali, effetti anti-angiogenici e anti-riassorbimento 2-7,17. Grazie all'applicazione di metodi di imaging su scanner per uso umano in un modello animale clinicamente rilevante, le procedure presentate sono di elevato valore traslazionale per la valutazione della risposta al trattamento nei pazienti con metastasi ossee 16.

In conclusione, utilizzando questo sito-specifico modello animale di metastasi ossee cancro al seno, aspetti morfologici e funzionali di angiogenesi possono essere esposte in maniera non invasiva e in vivo

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Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB-TR 23 e TR SFB-79, TB e DK). Gli autori desiderano ringraziare Bangert Renate, Karin Leotta e Lisa Seyler per un'eccellente assistenza tecnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 human breast cancer cells American Type Culture Collection HTB-26
RPMI-1640 Invitrogen 61870
FCS Invitrogen 10270
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300
Carprofen Rimadyl Pfizer Pharma GmbH PZN 110208
Magnevist Bayer-Schering PZN 6961516
Imeron 400 MCT Bracco PZN 228654
SonoVue Bracco PZN 1567358
Papaverin Alfa Aesar L 04152
Isofluran Baxter Internationl Inc. HDG 9623
Symphony (Magnetic resonance imaging) Siemens AG
Volume CT (Volumetric computed tomography) Siemens AG
Acuson Sequioa 512 (Ultrasound) Siemens-Acuson

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References

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Bäuerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound. J. Vis. Exp. (66), e4178, doi:10.3791/4178 (2012).More

Bäuerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound. J. Vis. Exp. (66), e4178, doi:10.3791/4178 (2012).

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