Syntetisk edderkoppespind Produktionen på laboratorieskala
Summary
Trods de fremragende mekaniske og biokemiske egenskaber af spindemider silke, kan dette materiale ikke kan høstes i store mængder ved hjælp af konventionelle midler. Her beskriver vi en effektiv strategi til at spinde kunstige edderkoppespind fibre, hvilket er en vigtig proces for efterforskerne at studere edderkoppespind produktion og deres anvendelse som næste generation biomaterialer.
Abstract
Som samfund skrider frem, og ressourcerne bliver færre, er det stadig mere vigtigt at opdyrke nye teknologier, ingeniør næste generation biomaterialer med højtydende egenskaber. Udviklingen af disse nye strukturelle materialer skal være hurtig, omkostningseffektiv og involverer behandling metoder og produkter, der er miljøvenlig og bæredygtig. Edderkopper spinder et væld af forskellige fibertyper med forskellige mekaniske egenskaber, som tilbyder en rig kilde til næste generation af konstruktionsmaterialer for biomimetik, at rivaliserende de bedste menneskeskabte og naturlige materialer. Siden indsamling af store mængder af naturlige edderkoppespind er upraktisk, syntetisk silke produktion har evnen til at give forskerne adgang til en ubegrænset forsyning af tråde. Derfor, hvis udspinding kan strømlines og perfektioneret, kunstige edderkopper fibre har potentiale brug for en bred vifte af applikationer lige fra skudsikre veste, kirurgisk suturs og tovværk, dæk, strygere til musikinstrumenter, og kompositter til luftfart og rumfart teknologi. For at fremme den syntetiske silke fremstillingsprocessen og til opnåelse af fibre, der vises lav varians i deres materialeegenskaber fra spin at spinde, har vi udviklet en vådspinding protokol, der integrerer ekspression af rekombinante edderkoppesilkeproteiner i bakterier, oprensning og koncentrering af proteinerne , efterfulgt af fiber ekstrudering og en mekanisk efter centrifugering behandling. Dette er det første visuelle repræsentation, som afslører en trin-for-trin proces at spinde og analysere kunstige silke fibre på en laboratorieskala. Det giver også nærmere at minimere indførelsen af variabilitet blandt fibre spundet af den samme roterende DOPE. Tilsammen vil disse metoder drive processen med kunstig silke produktion, hvilket fører til højere kvalitet fibre, der overgår naturlige edderkop silke.
Introduction
Edderkoppespind har ekstraordinære mekaniske egenskaber, der ud udfører flere menneskeskabte materialer, herunder højstyrkestål, Kevlar og nylon. 1 Edderkopper snurre mindst 6-7 forskellige fibertyper, der viser forskellige mekaniske egenskaber, hver designet med varierende mængder af trækstyrke og udvidelsesmuligheder til at udføre specifikke biologiske opgaver 2. Forskere er hurtigt at forfølge brugen af spider silke som næste generation biomaterialer på grund af deres fremragende mekaniske egenskaber, deres biokompatibilitet, og deres ikke-giftige og grønt-materielle natur. 3,4 grund af kannibalistiske og giftige karakter af spindlere, høst spider silke gennem landbrug er ikke en praktisk strategi for at opfylde de krav, der er nødvendige for industriel skala produktion. Derfor har forskere vendt til fremstilling af rekombinante silke proteiner i transgene organismer koblet med in vitro spinding af syntetiske fibre frafor sig oprensede proteiner. 5-8 Ekspression af fuld-længde rekombinante edderkoppesilkeproteiner er teknisk vanskeligt på grund af de iboende egenskaber ved de gensekvenser, der indbefatter deres yderst repetitive natur og fysiske længder (> 15 kb), GC-rigt indhold og forspændt alanin og glycin kodonanvendelse. 9-11 Til dato har de fleste laboratorier fokuseret på at udtrykke trunkerede former af de store ampullate silkeproteiner MaSp1 eller MaSp2 hjælp partielle cDNA-sekvenser eller syntetiske gener. 12-15 Spinning syntetisk spider silke er en vanskelig proces, der kræver beherskelse og viden i flere videnskabelige discipliner, og snørklede af spinding processen er ikke blevet fuldt afsløret for offentligheden ved hjælp af video repræsentation. Faktisk har kun en håndfuld laboratorier over hele verden ekspertise til at udtrykke de edderkoppespind cDNA'erne, rense silkeproteiner, spin syntetiske fibre og udførelse af post-spin uafgjort, og så endelig teste deres biomateriale egenskaber. 8,16,17 Forskellige tilgange til spinding syntetiske fibre er omfattet våde og tørre spinning samt electrospinning metoder 16,18,19 Alle procedurer har ét mål tilfælles -. Udvikling af en protokol, der producerer syntetisk edderkoppespind med mekaniske egenskaber, at rivaliserende naturlige tråde for store kommercielle fremstillingsprocesser.
Her beskrives proceduren til frembringelse kunstige spider silke i laboratoriemålestok under anvendelse af en vådspinding metode. I forhold til andre roterende metoder har vådspinding produceret de mest konsistente resultater for fiber-analyse. Vi beskrive denne procedure begynder med ekspressionen af de rekombinante silke proteiner i bakterier, efterfulgt af deres oprensning og beskriver derefter proteinpræparatet trin til spinding, herunder post-spin-trækning, der anvendes ved AS-spundne "fibre, som giver tråde med materialeegenskaber, der nærmer sig kvaliteten af naturlige spider silke. Vores methodology er designet til nøje at efterligne den naturlige udspinding af silke fibre, og det trækker kraftigt på vores ekspertise, arkitektur og funktion af silke-producerende kirtler fra Orb-og cob-vævning edderkopper. 20-22 Derudover, må vi konkludere med den nødvendige trin til at bestemme de væsentlige egenskaber ved de syntetiske fibre med en tensometer afbilde stress-strain kurver, som tillader forskere til at beregne den endelige styrke, endelige stamme, og sejheden af fibre. Endelig, men af betydelig værdi, kan de roterende, spole, og tegne apparater være hjemme-bygget ved hjælp af kommercielt tilgængelige dele, snarere end at købe omfattende og dyrt tilpasset udstyr.
Protocol
Discussion
Syntetiske fibre spundet af denne metodik er mekanisk på samme størrelsesorden i forhold til de naturlige fibre. Ved at nedsætte mængden af menneskelige fejl ved mekanisering køen og efterfølgende centrifugering draw fremgangsmåder er den eksperimentelle variation mellem prøver mere kontrolleret og i høj grad reduceret.
Vores metode giver mulighed for at undersøge de mekaniske egenskaber af andre fibre, der er spundet af rekombinante proteiner kodet af cDNA'erne for andre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NSF RUI Tilskud MCB-0950372 og DMR-1105310 med titlen "Molekylær Karakterisering af sort enke edderkop silke og mekaniske opførsel af Spider Lim Silks," hhv.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. . Biology of spiders. , (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. . Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C., Cuppoletti, J. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. 2, 303-324 (2011).
