Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal
Summary
Ondanks de uitstekende mechanische en biochemische eigenschappen van spin zijde, kan dit materiaal worden geoogst in grote hoeveelheden op conventionele wijze. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om kunstmatige spinnenzijde vezels, die is een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen van spinnenzijde productie en het gebruik ervan als next-generation biomaterialen te laten draaien.
Abstract
Naarmate de samenleving vordert en de middelen schaarser worden, wordt het steeds belangrijker om nieuwe technologieën te ontwikkelen die ingenieur volgende generatie biomaterialen met een hoge prestatie-eigenschappen. De ontwikkeling van deze nieuwe structurele materialen moet snel, kostenefficiënt en te betrekken verwerking van methoden en producten die milieuvriendelijk en duurzaam. Spinnen spinnen een veelheid van verschillende soorten vezels met verschillende mechanische eigenschappen en biedt een rijke bron van de volgende generatie technische materialen voor biomimicry die wedijveren met de beste door de mens veroorzaakte en natuurlijke materialen. Omdat het verzamelen van grote hoeveelheden natuurlijke spindraad is onpraktisch, synthetische productie van zijde heeft het vermogen om wetenschappers te voorzien van toegang tot een onbeperkt aanbod van draden. Daarom, als de draaiende proces kan worden gestroomlijnd en geperfectioneerd, kunstmatige spin vezels hebben het potentieel gebruik voor een breed scala aan toepassingen, variërend van kogelvrije kleding, chirurgische hechtingens, touwen en kabels, banden, snaren voor muziekinstrumenten, en composieten voor lucht-en ruimtevaart technologie. Met het oog op de synthetische zijde productieproces te bevorderen en de vezels die lage variantie weer te geven in hun materiële eigenschappen van draai te draaien geven, ontwikkelden we een natspinnen protocol dat de expressie van recombinante spindraad eiwitten in bacteriën, zuivering en concentratie van de eiwitten integreert , gevolgd door extrusie vezels een mechanische na rotatie behandeling. Dit is de eerste visuele voorstelling dat een stap-voor-stap proces openbaart te spinnen en te analyseren kunstzijde vezels op laboratoriumschaal. Het biedt ook gegevens aan het minimaliseren van de invoering van de variabiliteit onder vezels gesponnen uit dezelfde draaiende dope. Gezamenlijk zullen deze methoden voort te bewegen het proces van kunstzijde de productie, wat leidt tot hogere kwaliteit vezels die de natuurlijke spin zijde overtreffen.
Introduction
Spider zijde heeft een buitengewone mechanische eigenschappen die uit voert een aantal door de mens gemaakte materialen, waaronder staal met hoge treksterkte, Kevlar en Nylon. 1 Spiders draaien minimaal 6-7 verschillende soorten vezels, dat diverse mechanische eigenschappen weer te geven, elk ontworpen met verschillende hoeveelheden van de treksterkte en uitbreidbaarheid om specifieke biologische taken uit te voeren. 2 Onderzoek wetenschappers in hoog tempo het nastreven van het gebruik van de spin zijde als de volgende generatie biomaterialen omwille van hun uitstekende mechanische eigenschappen, hun biocompatibiliteit, en hun niet-toxisch en groen-materiële aard. 3,4 Vanwege de kannibalistisch en giftige karakter van de spinachtigen, oogsten spin zijde door de landbouw is niet een praktische strategie om aan de eisen die noodzakelijk zijn voor industriële schaal productie te voldoen. Daarom hebben onderzoekers zich tot de productie van recombinante eiwitten zijde in transgene organismen gekoppeld met vitro spinnen van kunstvezels dese gezuiverde eiwitten. 5-8 Expressie van volledige lengte recombinante spinnenzijde eiwitten is technisch moeilijk gezien de intrinsieke eigenschappen van hun gen-sequenties, die hun zeer repetitief karakter en de fysieke lengtes (> 15 kb) omvatten, GC-rijke inhoud en tendentieuze alanine en glycine codongebruik. 9-11 Tot op heden hebben de meeste labo's gericht op het uiten afgeknotte vormen van de belangrijkste ampullate zijde proteïnen MaSp1 of MASP2 met behulp van partiële cDNA sequenties of synthetische genen. 12-15 Spinning synthetische spin zijde is een uitdagend proces dat vereist beheersing en kennis van verschillende wetenschappelijke disciplines, en de fijne kneepjes van het draaien, niet zijn volledig geopenbaard aan het grote publiek door video vertegenwoordiging. In feite is slechts een handvol van laboratoria over de hele wereld hebben de expertise om de spin zijde cDNA's uit te drukken, te zuiveren van de zijde proteïnen, spin synthetische vezels en voer de post-spin tekenen, en dan uiteindelijk testen hun biomateriaal eigenschappen. 8,16,17 Verschillende benaderingen voor het spinnen van synthetische vezels zijn omgeven natte en droge spinnen en electrospinning methoden 16,18,19 Alle procedures hebben een doel gemeen -. Ontwikkeling van een protocol dat synthetische spinnenzijde produceert met mechanische eigenschappen die rivaal natuurlijke onderwerpen die voor grootschalige commerciële productie processen.
Hier beschrijven we de procedure om kunstmatige spin zijde op laboratorium schaal met behulp van een natspinnen methodiek te genereren. Ten opzichte van andere spinnen methoden, heeft natspinnen geproduceerd de meest consistente resultaten voor vezels analyse. Wij beschrijven deze procedure begint met de expressie van de recombinant eiwitten zijde in bacteriën, gevolgd door zuivering ervan, en een beschrijving van de eiwitpreparaat stappen voor het spinnen met een post-spin draw methode toegepast op "zo gesponnen" vezels draden oplevert met eigenschappen van het materiaal dat de kwaliteit van de natuurlijke spin zijde te benaderen. Onze methodologischey is ontworpen om de voet na te bootsen de natuurlijke spinproces van zijde vezels en het trekt een zware wissel op onze kennis van de architectuur en de functie van de zijde-producerende klieren van bol-en cob-weven spinnen. 20-22 Verder sluiten we af met de nodige stappen van de materiaaleigenschappen van de synthetische vezels met een tensometer stress-rek krommen, waardoor onderzoekers de uiteindelijke sterkte, uiteindelijke spanning en taaiheid van vezels berekenen uitzetten bepalen. Ten slotte, maar van aanzienlijke waarde, kan de spinnen, wikkelen, en tekenen apparaten thuis te zijn gebouwd met behulp van commercieel verkrijgbare onderdelen, in plaats van de aankoop van ingewikkelde en kostbare apparatuur op maat.
Protocol
Discussion
Synthetische vezels gesponnen van deze methode zijn mechanisch op dezelfde orde van grootte vergeleken met de natuurlijke vezels. Door het verminderen van de hoeveelheid van menselijke fouten door mechanisatie van het in de wachtrij en na de spin-loting processen, de experimentele variatie tussen monsters zijn meer gecontroleerd en sterk verminderd.
Onze methodologie biedt het potentieel om de mechanische eigenschappen van andere vezels die worden gesponnen uit recombinante eiwitten gecodeer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NSF RUI Subsidies MCB-0950372 en de DMR-1105310 getiteld "moleculaire karakterisering van Black Widow Spider zijde en mechanisch gedrag van Spider Glue Silks," respectievelijk.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. . Biology of spiders. , (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. . Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C., Cuppoletti, J. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. 2, 303-324 (2011).
