Summary
Trots de enastående mekaniska och biokemiska egenskaper hos spindel siden, kan detta material inte tas ut i stora mängder med konventionella medel. Här beskriver vi en effektiv strategi för att snurra regenatfibrer spindeltråd, vilket är en viktig process för utredarna studerar spindeltråd produktion och deras användning som nästa generations biomaterial.
Introduction
Spider silk har extraordinära mekaniska egenskaper som anges utför flera konstgjorda material, inklusive höghållfast stål, Kevlar och nylon. 1 Spindlar spinner minst 6-7 olika fibertyper som visar olika mekaniska egenskaper, var utformade med varierande mängder av draghållfasthet och utbyggbarhet för att utföra specifika biologiska uppgifter. 2 Forskare snabbt vidare med användningen av spindel silke som nästa generations biomaterial på grund av deras utmärkta mekaniska egenskaper, biokompatibilitet och deras icke-toxiska och grön-materiell natur. 3,4 grund av kannibalistiska och giftig art spindeldjur, skörd spindel silke genom jordbruk är inte en praktisk strategi för att möta de krav som är nödvändiga för industriell skala tillverkning. Därför har forskare visat att produktionen av rekombinanta silke proteiner i transgena organismer i kombination med in vitro-spinning av syntetiska fibrer från dense-renade proteiner. 5-8 Redovisning av full längd rekombinanta proteiner spindeltråd har varit tekniskt svårt med tanke på de inneboende egenskaperna hos sina gensekvenser, som omfattar deras mycket repetitiv karaktär och fysiska längd (> 15 kb), GC-rikt innehåll och partiska alanin och glycin kodonanvändning. 9-11 Hittills har de flesta laboratorier fokuserat på att uttrycka trunkerade former av de stora proteinerna ampullate siden MaSp1 eller MaSp2 med partiella cDNA-sekvenser eller syntetiska gener. 12-15 Spinning syntetiskt spindel silke är en utmanande process som kräver mästerskap och kunskap inom flera vetenskapliga discipliner, och krångligheter i spinning processen har inte helt avslöjas för allmänheten genom video representation. Faktum är att endast en handfull laboratorier över hela världen har kompetens att uttrycka spindeltråd cDNA, rena silkesproteiner, snurra syntetiska fibrer och utföra post-spin drag, och sedan slutligen testa sina biomaterial egenskaper. 8,16,17 Olika metoder för spinning syntetiska fibrer har omfattat vått och torrt spinning samt electrospinning metoder 16,18,19 Alla förfaranden har ett mål gemensamt -. Utveckling av ett protokoll som producerar syntetiska spindeltråd med mekaniska egenskaper som konkurrerande naturliga ämnen för storskaliga kommersiella tillverkningsförfaranden.
Här beskriver vi proceduren för att skapa konstgjorda spider sidentyger i laboratorieskala med en våtspinning metod. I förhållande till andra spinning metoder har våtspinning gett de mest konsekventa resultaten för fiber analys. Redogör vi för detta förfarande börjar med expression av de rekombinanta silkesproteiner i bakterier, följt av deras rening, och sedan beskriva de olika stegen protein förberedelse för spinning, inklusive en post-spin drag metod som tillämpas på "as-spunna" fibrer som ger trådar med materialegenskaper som närmar sig kvaliteten av naturliga spindel silke. Vår methodology är utformad för att efterlikna den naturliga snurrande processen siden fibrer och den drar starkt på vår expertis arkitektur och funktion silk-producerande körtlar från klot-och Cob-vävning spindlar. 20-22 Dessutom avslutar vi med de nödvändiga steg för att bestämma de väsentliga egenskaperna hos syntetfibrer med användning av en tensometer att plotta spännings-töjningskurvor, som tillåter forskare att beräkna den slutliga hållfasthet, ultimat töjning och seghet av fibrer. Sist men av betydande värde, kan de spinning, buffra, och rita apparater vara hemma-byggd med kommersiellt tillgängliga delar, snarare än att köpa kostsamma anpassad utrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Grafisk översikt: Biomimicry av spinningsprocess
Biomimicry av den naturliga spindelnät produktionskedja. En rutt för att tillverka syntetisk silk Denna bild visar den stora ampullate körteln från den gyllene klot vävaren, Nephila clavipes, och de komponenter som används för natursilke produktion (vit text). Svansregionen syntetiserar stora mängder silkesprotein som transporteras till den ampull, en lagringsyta för den roterande DOPE. Denna koncentrerade dopa extruderas genom den roterande trumman, där lösningen utsätts jonbyten och uttorkning före fibern strängsprutning. De biomimetiska processer som används i vårt laboratorium indikeras av röd text. Rekombinant sidenproduktionen genereras med hjälp av transgena bakterier, följt av proteinrening med kromatografi. Därefter är det renade proteinet subtet för lyofilisering för att koncentrera det material. Slutligen är det protein som återupplöses i HFIP och extruderades från en injektionsnålen i en isopropanol-bad.
1. Plasmid Konstruktion och bakteriecellkultur Förberedelser
- Utför PCR med önskad spindeltråd cDNA och specifik primer set. Gel-extrakt och ligera den amplifierade cDNA in i en prokaryot expressionsvektor t.ex. pBAD / TOPO ThioFusion (Fig. 1 A). Denna vektor har ett N-terminalt tioredoxin tagg för att underlätta solubilisering silkesprotein och en C-terminal 6x his-tagg för proteinrening. Transformera ligeringsprodukterna till kompetenta E. coli-celler.
- Välja kolonier som innehåller den rekombinanta klonings-vektor och använda en koloni att ympa 200 ml sterilt LB kompletterat med ampicillin (Fig. 1 B). Odla denna kultur över natten till mättnad genom skakning vid 200 rpm i en orbital inkubator vid 37 ° C.
- Kombinera 200 ml av mättade strömtransformared kultur med 800 ml färskt LB-odling. Inducera uttryck spindel silkesprotein under 4 timmar genom tillsats av 0,2% arabinos (vikt / volym). Se till att hålla kulturen i antibiotikaselektion.
- Pelletera cellerna vid 16.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C (fig. 1C). För enkelhetens skull pellets hela volymen i en behållare. Flera centrifugeringssteg kan vara nödvändig beroende på volymen kapacitet centrifugering rören. Om det behövs, häll över vätskan volymen efter spinning och re-pellet ytterligare material för att säkerställa hela cellpelleten finns i en behållare. Cellpelletar kan lagras vid -80 ° C tills de behövdes.
- Innan du gör de förbrukade odlingsmedia, lägga blekmedel eller autoklaveras för att sterilisera.
2. Cellys
- Tillsätt 20 ml 1 x lysbuffert till 1 L cellpelleten (fig. 2A). Se till att resuspendera cellpelleten helt.
- Lägg lysozym till en koncentration av 1 mg / ml till främja ytterligarecellys. DNas kan även tillsättas vid detta steg för att smälta kromosomalt DNA för att hjälpa till att minska viskositeten hos lösningen. Placera provet på en orbitalskakare och skaka försiktigt under 20 min.
- Sonikera lösningen vid maximal under 1 minut.
- Att klargöra lösning, centrifug vid 16.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C (fig 2B).
3. Protein Purification: Ni-NTA-affinitetskolonnkromatografi
- Avlägsna supernatanten och överföra den till en ren 25 ml kromatografikolonn. Se till supernatanten är icke-viskös och klar. Om lösningen är viskös och grumligt, tillsätt mer DNas eller sonikat och / eller re-pellet supernatanten (Upprepa steg 2,3-2,4).
- Tillsätt 1 ml Ni-NTA-uppslamning (0,5 ml pärlor) i kolonnen. Hårt säkra den gemensamma jordbrukspolitiken och kran, och ställ sedan in på en rocker komma i jämvikt i 1 timme för att möjliggöra bindning av 6x His-taggen för att Ni-NTA pärlor (Fig. 3A).
- Ställa in spalten upprätt på enstå och låta Ni-NTA-pärlor till bottnen under ungefär 2 minuter. En ljusblå lager kan ses på botten när pärlorna är helt avvecklas.
- Avlägsna locket och tillåter lösningen att strömma genom kranen. Samlar in denna lösning för ytterligare analys (fig. 3B).
- Tillsätt 20 ml 1 x tvättbuffert och tillåta pärlorna sedimentera. Öppna kranen och tillåta lösningen att passera. Samla denna lösning i fyra 5 ml portioner för vidare analys Obs: Ytterligare tvätt volymer kan användas för att minska förorenande proteiner, men det finns en risk för en minskning av den slutliga proteinutbytet..
- Tillsätt 20 ml 1 x elueringsbuffert och tillåta hartsen att sedimentera. Öppna kranen och tillåta lösningen att passera. Samla denna lösning i fyra 5 ml portioner för vidare analys OBS:. Ytterligare elueringsvolymer kan hämtas från Ni-NTA-harts om elueringen inte fullföljs.
- Prov kan förvaras i 4° C eller -80 ° C under kortare eller längre tids lagring, respektive.
- Storleken-fraktionera proverna med användning av SDS-PAGE-analys. Synliggöra proteinerna med silver eller Coomassie Brilliant Blue R-250 (fig. 3C). Enbart rena fraktionerna bör användas för de följande stegen Anm. Western blot-analys kan användas för att bekräfta identiteten av det renade proteinet.
4. Dialys och lyofilisering
- Dialysera proverna mot åtminstone 100x prowolymen (använda avjoniserat vatten) under 2 dagar. Ändra vattenlösning var 6 timmar för att avlägsna alla salter Anm. Molekylvikten storlek cut-off av dialysslang beror på storleken av det rekombinanta silkesprotein.
- Väg sex 1,5 ml tomma mikrocentrifugrör och registrera deras massa. Det kan vara lämpligt att punktera små hål eller slitsar i lock på rören före vägning för frystorkning för att underlätta lyofilisering (fig. 4A).
- Frånter dialys, över 1 ml av det dialyserade provet i vardera av de 6 förvägt mikrocentrifugrör (fig. 4B). Flash frysa med flytande kväve och torka proverna ner med en frystorkare (Fig. 4C).
- Efter torkningen överföra ytterligare 1 ml av dialys provet i vardera av de sex rör. Upprepa tills hela dialysen provet har torkats i de mikrocentrifugrör.
- Frystorkade prover kan lagras vid -80 ° C under långtidslagring.
5. Spinning Dope Preparation
- Väga varje mikrocentrifugrör innehållande det torkade proteinet pulver. Subtrahera den första massan av de tomma rören för att få totala torra proteinmassa Obs:. Beroende på protein avkastning, kan du behöva för att rena ytterligare material för spinning processen.
- Beräkna volymen av hexafluorisopropanol (HFIP) för att lägga till varje rör för att erhålla 200 mg / ml till 500 mg / ml, eller 20% till 50% vikt per volym. Tillsätt lämpåt mängd HFIP i varje rör (Fig. 4D) Anm.: HFIP är mycket flyktig och giftig, pipett försiktigt och mössa röret så snart som möjligt. HFIP ska hanteras under en skyddshuv.
- Parafilm rören och placera på en rocker att lösa proteinet. Vortex och centrifugera ibland för att underlätta upplösning. Det kan ta upp till 2 dagar.
6. Spruta Förberedelser och Apparatus Setup
- Ladda åtminstone 25 | il av den solubiliserade snurrande cellulosalösningen i sprutan. Kontrollera att det inte finns några aggregat så kan det täppa till sprutan. Notera: Detta prov är otroligt trögflytande, så var försiktig när pipettering.
- Tryck knark på framsidan av sprutan vertikalt, ta bort alla luftbubblor (fig. 5A) Obs:. Luftbubblor skapar inkonsekvenser i fibern.
- Lås sprutan till pumpen. Höja en 400 ml bägare fylld med 95% isopropanol upp så att sprutspetsenär precis bryter ytan av alkoholen (fig. 5B).
- Ställ sprutpumpen till 15 pl / min och starta programmet. Tillåta den spunna fibern att sitta i isopropanol under 20 minuter för att fullständigt ekvilibrera Anm. Dessa fibrer kan fortfarande användas av MS / MS-analys för att bekräfta identiteten av de proteiner i fibrerna.
7. Post-spin Draw och Provtagning
- Tillämpas dubbelsidig tejp till båda sidor av kammen på buffring anordningen. Den buffring anordning skapades från limning metall kammar till en digital tjocklek (fig 6A). Fäst buffring anordningen till en motor (fig. 6B). Vi rekommenderar spolar trådarna vid 2 rpm Anm.: Snabbare buffring priser resulterar i stora mängder variation i fiberkvaliteten och reproducerbarhet.
- Använd pincett försiktigt ta den ena änden av fibern och sakta dra ur isopropanol, kopplar den till kanten av en av de kam armarna på spolen (FIG. 6C). De kommande stegen bör göras utan ett stopp för att hindra fibrerna från att torka ut.
- Slå på motorn och försiktigt styra fibern på buffring enheten OBS:. Under buffring, inte tillåter fibern att dubbla upp och stapla ovanpå varandra.
- När hela fibern buffras, bort spolen från motorn och applicera lim på kanten av varje siden fiber på den dubbelsidiga tejpen (Fig. 6D). Detta fäster spindeltråd på apparaten Anm.: Genom att limmet till dubbelhäftande tejpen innan post-spin ritning, hindrar det hela fibern glider och möjliggör selektiv sträckning av de inre segmenten av fibrerna i bromsoket armar.
- Fäst spolen att det linjära manövreringsorganet (figur 7A). Anteckna första längden av fibrerna med hjälp av bromsok Observera att detta är den interna längden av fibern,. Det inte innehåller längden limmade och svepte around spolen.
- Sänk spolen i en 75% isopropanol bad. Tillåta fibrerna att jämvikta i 10 minuter Not:. Andra dehydratiserande lösningar kan användas för spinningsprocessen, såsom metanol, aceton och ammoniumsulfat.
- Ställa det linjära manövreringsorganet hastigheten till 1,5 mm / sek. Baserat på den initiala längden, beräkna den slutliga längden för den önskade efter-spinn sträckningsförhållande. Beloppet sträckte kan styras baserat på hastighet eller längden, beroende på den inställda upp. Till exempel, med en initial längd av 15 mm och en önskad post-spinn sträckningsförhållande av 3x, bör den slutliga längden vara 45 mm. Detta kan också beräknas som driver det linjära manöverdonet i 20 sekunder vid en hastighet av 1,5 mm / sek.
- När den önskade tjänsten spin drag är klar, sakta höja spolen ur isopropanol. Tillåta dropparna av isopropanol för att torka under 1 minut, och sedan samla prover (Fig. 7B). Prover ska monteras på kartong eller folie ramar för att testa purposer.
- Om ytterligare efter spin sträckningsförhållanden önskas, sänker spolen tillbaka till 75% isopropanol bad. Låt fibrerna i jämvikt i 10 minuter och sedan gå vidare till nästa inlägg spin dragförhållandet.
8. Dragprovning
- Låt insamlade proven för att jämvikt till standarden labbmiljö under minst 1 timme före mekanisk testning. Fuktighet och temperatur skall registreras som de kan påverka fiberns mekaniska egenskaper. Standard fuktighet och temperatur bör vara ungefär 40% och 25 ° C, respektive.
- Lim kanter cardstock eller folie för att fästa fibern på ramen. Ta del av storleken på öppningen av ramen. Detta är den första längden på din testade fiber. En 1 tum (25,4 mm) öppning ram visas här (figur 8A).
- Användning av ett ljusmikroskop med en 100x eller större förstoring, ta diametermätningar längs den längsgående fiberaxeln.Minst 3 mätningar bör registreras. Ju högre förstoringen som används och ju fler mätningar desto bättre noggrannhet.
- Fästa ramen till en tensometer mekanisk belastning ram (Fig. 8B). Skära ram på båda sidor så att spänningen endast löper genom fibern. Tare i tensometer och samla data. En standard stam på 2% per sekund.
- Med hjälp av de insamlade data och den genomsnittliga diameter, kan en spänning töjningskurva ritas.
- Den brutna fibrer kan nu monteras på ett svepelektronmikroskop (SEM) stöta för morfologiska analyser och brytpunkt mätningar diameter. Fibern segmentet bort från brottpunkten kan användas för att uppskatta och kontrollera den initiala diametern mäts med ljusmikroskop.
9. Representativa resultat
Från steg 3, bör de olika fraktionerna analyseras med SDS-PAGE-analys och proteinerna visualiserades med silvereller Coomassie Brilliant Blue R-250. Från en standard Ni-NTA-kolonn betingelser kan elueringsfraktioner med> 90% renhet erhållas (Fig. 9). Små kontaminerande proteiner kan längre bort genom omfattande dialys. Användning av 25 | il av spinning spinnlösning vid 20% (vikt / volym), kan åtminstone 30 olika fibrer prover tas ut från den kontinuerliga lindade fibern på spolen (förutsätter en initial längd av 13 mm användes). De mekaniska egenskaperna kan analyseras med Tensometer prov (Fig. 10). Beroende på det rekombinanta silkesprotein används för spinnprocess kommer de maximala efter centrifugering dragförhållanden måste bestämmas empiriskt. I allmänhet, posta spinn dragförhållanden av 4.0x kan uppnås utan fiberbrott (Fig. 10). Spunna fibrer, före eller efter efter centrifugering dragning, kan analyseras med ett svepelektronmikroskop för att visualisera ultrastrukturen (fig. 11A, B). Spunna fibrer kan också användas för mekanisk testning, visning av resultatatt med låg variation i ett inlägg spin dragningsförhållande urvalsgrupp (Fig. 10).
Figur 1. Redovisning av spindelnät cDNA i bakterier. A) pBAD TOPO / Thio vektorn innehållande spindeltråd cDNA av intresse omvandlas till kompetent E. coli-celler. B) En enda koloni inokulerades i 200 ml LB och odlades till mättnad över natten. Efter ympning, är 800 ml färskt LB tillsattes och kulturen inducerades för expression med användning av arabinos. C) Vid slutet av induktion, är kulturen genom centrifugering. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Lys av bakterieceller efter spider silkesprotein induktion. A) Tjugo milliligor av 1 gång lysbuffert och DNas sätts till cellpelleten och placerades på en orbital skakanordning och sonikerades för att lysera cellerna. B) cellysatet spinns i en centrifug för att rensa supernatanten av cellulärt skräp, och supernatanten samlas upp. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Rening av spindelsilke rekombinanta proteiner med användning av affinitetskromatografi. A) Cellysatet supernatanten och Ni-NTA-pärlor sätts till en kromatografikolonn och inkuberades under 1 timme. B) Efter genomflödet uppsamlas, är 20 ml tvättbuffert och 20 ml elueringsbuffert användes i sekvens och uppsamlades i 5 ml fraktioner. C) De olika fraktionerna analyserades med SDS-PAGE, och de rena prover innehållande målproteinet överförs till en dialyspåse och dialyserades mot avjoniserat vatten tillslutförande. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Beredning av renade spindelnät protein för våtspinning. A) Den dialyserade produkten överförs till pre-vägda centrifugrör i 1 ml alikvoter. B) De alikvoter om 1 ml är blinka frystes med flytande kväve. C) De frysta proverna lyofiliserades och mer dialys provet tillsätts. D) Torkad massa beräknas och HFIP läggs till det torra pulvret för att producera en 20% (w / v) spinning knark. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Laddning av spinning knark i glaset sprutan för våtspinning. A) Håll syrinGE vertikalt, är den snabbt roterande dopa skjuts upp till toppen av sprutan kolonnen, avlägsna luftbubblor. B) laddades sprutan är fäst vid sprutpumpen och sänktes in i 95% isopropanol-bad så att spetsen är precis bryter ytan av badet.
Figur 6. Spol av de syntetiska fibrerna spindelsilke på en anpassad upprullningsanordningen. A) buffring anordningen är konstruerad av ett digitalt skjutmått med bifogade metall kammar. Dubbelsidig tejp appliceras på båda sidor av kammen för att fästa fiberändarna. B) Spolen är fäst vid låg hastighet motorn med användning av en krokodilklämma. C) Fibern långsamt dras från alkoholen badet och lindas runt spolen. D) Lim appliceras på kanten av varje fibersegment att hålla dem på plats. Visas är två olika fibrer spunna från olika proteiner.
Figur 7. Efter centrifugering dra av de syntetiska fibrerna med användning av en hemlagad apparat. A) buffring anordningen är fäst till det linjära manövreringsorganet inställning med krokodilklämmor. B) Efter ett inlägg spin oavgjort steget spolen lyfts från badet. Isopropanol droppar får avdunsta innan fiber samling.
Figur 8. Montering av de syntetiska siden fibrerna på en cardstock för mekaniska studier. A) samlas in fibrer monterade på kartong ramar med en 1 "x 1" utskärningen. Fibrerna initialt hålls på plats med dubbelsidig tejp, och fixerades sedan med lim. B) cardstock ramen är fäst på en tensometer. Sidorna är sedan klippa så att spänningen bara kör dock fibern.
Figur 9. Storleksfraktionering av renat rekombinant MaSp1 protein fraktioner med användning av SDS-PAGE-analys följt av visualisering med silver-färgning. Protein stege avbildas i kDa. De två tvätt proverna visa icke-specifik bindning till pärlorna, medan eluerings proverna visar på behovet av 6 samlingar för att säkerställa total protein återhämtning.
Figur 10. Stress töjningskurvor av fibrer spunnet av rekombinanta TuSp1 proteiner. 8 färger visar fibrer som var föremål för olika rita post spin förhållanden, från 2,5 x till 6x. Fibrer visar låg variation inom sin kvot grupp, som post spin sträckningsförhållanden ökar, är styrkan i fibern ökade, medan töjbarhet minskar.
Figur 11. Svepelektronmikroskopi bilder av fibrer spunna från rekombinanta TuSp1 proteiner. A) Vid 500x förstoring en smidig externyta kan ses. B) Vid 5000X kan täta inre kärnan observeras från en naturlig paus fiber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syntetiska fibrer spunna av denna metod är mekaniskt på samma storleksordning jämfört med den naturliga fibrer. Genom att minska mängden mänskliga fel genom mekanisering av buffring och efter spin processer rita, den experimentella variationen mellan prover är mer kontrollerad och kraftigt reducerad.
Vår metodik ger möjlighet att undersöka de mekaniska egenskaperna hos andra fibrer som är spunna från rekombinanta proteiner som kodas från cDNA andra medlemmar av spider genfamilj. Potentiellt kan det avgöra mekaniska betydelsen av olika proteiner moduler inom en fibroin, eller mellan de olika fibroin typerna 23. Vidare möjliggör testning av silke fibrer som kompositer, som mer än en silkesprotein eller andra molekyler kan kombineras eller läggas och centrifugerades såsom en proteinblandning.
Detta spinning metod är en plattform för andra laboratorier att enkelt utöka på, eftersom apparatuses kan konstrueras på ett enkelt sätt. Detta tillåter också för att justera parametrar längs varje steg för att optimera eller anpassa utformningen av specifika fibrer med unika mekaniska egenskaper. Eftersom behovet av gröna biomaterial för framtida ökningar kan denna metod anpassas för att producera fibrer som tjänar en mängd av nästa generations applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF RUI Grants MCB-0950372 och DMR-1105310 titeln "Molecular Characterization of Black Silks änka, maskin-och beteende Spider Lim Silks," respektive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).
