ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה
Summary
למרות תכונות מכניות ביוכימי הבולטים של משי עכביש, חומר זה לא ניתן לקצור בכמויות גדולות באמצעים קונבנציונליים. כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה לטוות קורי עכביש מלאכותיים סיבי, שהוא תהליך חשוב עבור החוקרים הלומדים ייצור עכביש המשי ואת השימוש בהם הדור הבא של biomaterials.
Abstract
כחברה מתקדמת ומשאבים להיות נדיר, הוא הופך חשוב יותר ויותר לטפח טכנולוגיות חדשות הקרובות מהנדס הדור biomaterials עם תכונות ביצועים גבוהים. פיתוח של חומרים אלה מבניים חדשים חייבת להיות מהירה, יעילה וחסכונית, הכרוכה שיטות עיבוד מוצרים ידידותיים לסביבה בת קיימא. עכבישים לטוות רב של סוגי סיבים שונים עם תכונות מכניות שונות, מציע מקור עשיר של הנדסת חומרים הדור הבא של ביומימטיקה כי יריבות חומרים מעשה ידי אדם וטבעי ביותר. מאז אוסף של כמויות גדולות של משי עכביש טבעי אינו מעשי, ייצור משי סינתטי יש את היכולת לספק למדענים גישה אספקה בלתי מוגבלת של נושאים. לכן, אם תהליך ספינינג יכול להיות יעיל שלמות, סיבי עכביש מלאכותיים יש שימוש פוטנציאלי במגוון רחב של יישומים החל שריון הגוף, תפר כירורגיים, חבלים וכבלים, צמיגים, מחרוזות עבור כלי נגינה, וחומרים מרוכבים עבור טכנולוגיות תעופה וחלל. על מנת לקדם את תהליך ייצור משי סינתטי להניב סיבים המציגים שונות נמוכה תכונות החומר שלהם לטוות ספין, פיתחנו פרוטוקול רטוב ספינינג המשלבת ביטוי חלבונים רקומביננטיים עכביש המשי של טיהור, חיידקים וריכוז החלבונים , ואחריו שחול סיבים טיפול מכני שלאחר ספין. זהו ייצוג חזותי 1 החושף תהליך צעד אחר צעד להסתובב ולנתח סיבי משי מלאכותי בקנה מידה מעבדתי. הוא גם מספק פרטים כדי למזער הכנסת השונות בין סיבים שנטוו בין סמים ספינינג אותו. באופן קולקטיבי, שיטות אלה יניע את התהליך של ייצור המשי המלאכותי, המוביל סיבים באיכות גבוהה יותר כי יעלה משי עכביש טבעי.
Introduction
קורי עכביש בעל תכונות מכאניות יוצאות דופן, כי את מבצעת חומרים מעשה ידי אדם, ובהם פלדה גבוהה מתיחה, Kevlar ניילון. 1 עכבישים לטוות לפחות 6-7 סוגי סיבים שונים המציגים תכונות מכניות שונות, כל אחת מעוצבת עם כמויות משתנות של עוצמה הרחבה מתיחה כדי לבצע משימות ביולוגיים ספציפיים. 2 מדענים מחקר הם במהירות רודף את השימוש של משי עכביש כמו biomaterials הדור הבא בגלל תכונות מכאניות יוצאות דופן שלהם, biocompatibility שלהם, והטבע רעיל ירוק החומר שלהם. 3,4 בגלל קניבלית ו הטבע ארסית של Arachnids, קציר משי עכביש באמצעות חקלאות היא לא אסטרטגיה מעשית על מנת לעמוד בדרישות הנחוצות לייצור בקנה מידה תעשייתי. לכן, מדענים פנו לייצור חלבונים רקומביננטיים משי של האורגניזם המהונדס יחד עם במבחנה ספינינג של סיבים סינתטיים מse חלבונים מטוהרים. 5-8 Expression של באורך מלא חלבונים משי רקומביננטי עכביש כבר קשה מבחינה טכנית נתון את המאפיינים הפנימיות של רצפי גנים שלהם, אשר כוללים הטבע חוזר על עצמו ביותר שלהם ואת אורכי פיזיים (> 15 kb), GC-עשיר תוכן ו מוטה אלאנין ו גליצין השימוש קודון. 9-11 כדי תאריך, רוב Labs התמקדו להביע את צורות חתוכים של משי את החלבונים העיקריים ampullate MaSp1 או MaSp2 תוך שימוש רצפים cDNA חלקיים או גנים סינתטיים. 12-15 טוויה סינתטי עכביש בדי משי הוא תהליך מאתגר כי דורש מאסטריות ואת הידע ב דיסציפלינות מדעיות כמה, ו המורכבויות של תהליך ספינינג שלא היה חשף באופן מלא לציבור הרחב על ידי ייצוג וידאו. למעשה, רק קומץ של Labs על פני הגלובוס יש את המומחיות להביע את את cDNAs משי עכביש, לטהר את את החלבונים משי, ספין סיבים סינתטיים ולבצע המשתמש הודעה-ספין תיקו ולאחר מכן סוף סוף לבדוק על מאפיינים ביולוגי שלהם. 8,16,17 גישות שונות של סיבים סינתטיים ספינינג לא הקיפה ספינינג רטובה ויבשה כמו גם שיטות electrospinning 16,18,19 הליכי כל יש מטרה אחת משותפת -. פיתוח פרוטוקול שמייצר קורי עכביש סינתטי בעל תכונות מכאניות כי הנושאים טבעיים יריבות עבור בקנה מידה גדול תהליכי ייצור מסחריות.
כאן אנו מתארים את ההליך להפקת משי עכביש מלאכותיים בקנה מידה במעבדה באמצעות מתודולוגיה רטוב ספינינג. לעומת שיטות אחרות ספינינג, ספינינג רטובים הפיק את התוצאות העקביים ביותר לניתוח סיבים. אנחנו מתווה זה תחילת ההליך עם ביטוי של חלבונים משי רקומביננטי בחיידקים, ואחריו טיהור שלהם, ולאחר מכן לתאר את שלבי הכנת חלבון ספינינג, כולל מתודולוגיה שלאחר ספין תיקו ליישם סיבי "כפי הסתחרר" כי התשואות האשכולות עם חומר מאפיינים להתקרב איכות משי עכביש טבעי. שלנו methodology נועד מקרוב לחקות את התהליך הטבעי של ספינינג סיבי משי היא שואבת במידה רבה על המומחיות שלנו הארכיטקטורה והתפקוד של משי לייצור בלוטות מ-Orb ו-קלח אריגה עכבישים. 20-22 יתר על כן, אנו מגיעים למסקנה עם צורך השלבים הבאים כדי לקבוע את תכונות החומר של סיבים סינתטיים באמצעות tensometer להתוות ללחץ ומתח עקומות, המאפשרים לחוקרים לחשב את הכוח האולטימטיבי, זן האולטימטיבי, וקשיחות של סיבים. לבסוף, אך בעל ערך משמעותי, מנגנוני ספינינג, עקיפה, ציור יכול להיות בית נבנה באמצעות חלקים זמינים מסחרית, יותר מאשר רכישת ציוד מותאם אישית משוכלל ויקר.
Protocol
Discussion
סיבים סינתטיים הסתחרר מן המתודולוגיה זה הם מכנית על אותו סדר גודל לעומת סיבים טבעיים. על ידי הפחתת כמות טעויות אנוש על ידי mechanizing עקיפה ומסובב הודעה תהליכים לצייר, וריאציה ניסיוני בין דגימות נשלטים יותר פחותה בהרבה.
המתודולוגיה ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NSF רוי מענקים MCB-0950372 ו DMR-1105310 תחת הכותרת "אפיון מולקולרית של שחור עכביש משי אלמנות התנהגות מכנית של משי עכביש דבק", בהתאמה.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. . Biology of spiders. , (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. . Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C., Cuppoletti, J. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. 2, 303-324 (2011).
