Sintetico di produzione Spider Silk su scala di laboratorio
Summary
Nonostante le notevoli proprietà meccaniche e biochimiche di seta di ragno, questo materiale non può essere raccolto in grandi quantità con mezzi convenzionali. Qui descriviamo una strategia efficace per far girare fibre artificiali in seta di ragno, che è un processo importante per i ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e il loro uso come biomateriali di nuova generazione.
Abstract
Mentre la società progredisce e le risorse diventano più rari, sta diventando sempre più importante per coltivare nuove tecnologie che biomateriali ingegnere prossima generazione con caratteristiche ad alte prestazioni. Lo sviluppo di questi nuovi materiali strutturali deve essere rapido, conveniente e le metodologie di lavorazione e prodotti rispettosi dell'ambiente e sostenibili. Ragni tessono una moltitudine di diversi tipi di fibra con proprietà meccaniche diverse, offrendo una ricca fonte di materiale per la prossima generazione di ingegneria biomimicry che i rivali con i migliori materiali naturali o causati dall'uomo. Dato che la raccolta di grandi quantità di seta di ragno naturale è impraticabile, la produzione di seta sintetica ha la capacità di fornire agli scienziati l'accesso a una riserva illimitata di thread. Pertanto, se il processo di filatura può essere semplificato e perfezionato, ragno fibre artificiali hanno il potenziale utilizzo per una vasta gamma di applicazioni che vanno da giubbotti antiproiettile, sutura chirurgicas, corde e funi, pneumatici, corde per strumenti musicali, e compositi per l'aviazione e la tecnologia aerospaziale. Per far avanzare il processo di produzione della seta sintetica e per produrre fibre che visualizzano la varianza bassa nelle loro proprietà del materiale dallo spin a girare, abbiamo sviluppato una filatura a umido protocollo che integra l'espressione di proteine ricombinanti in batteri seta di ragno, la purificazione e la concentrazione delle proteine , seguita da estrusione fibra e uno meccanico post-rotazione trattamento. Questa è la prima rappresentazione visiva che rivela un passo-passo processo a girare e analizzare fibre di seta artificiali su scala di laboratorio. Fornisce inoltre i dettagli per ridurre al minimo l'introduzione della variabilità tra le fibre filate dalla droga stessa filatura. Collettivamente, questi metodi spingerà il processo di produzione della seta artificiale, che porta alle fibre di qualità superiore che superano sete ragno naturali.
Introduction
Seta di ragno ha straordinarie proprietà meccaniche che esegue i materiali artificiali, tra cui acciaio ad alta resistenza, Kevlar e Nylon. 1 ragni tessono almeno 6-7 diversi tipi di fibra che consentono di visualizzare le proprietà meccaniche diverse, ognuna progettata con quantità variabili di resistenza alla trazione ed estensibilità per eseguire specifici compiti biologici. 2 Ricercatori stanno rapidamente perseguendo l'uso della seta di ragno, come biomateriali di nuova generazione a causa delle loro eccezionali proprietà meccaniche, la loro biocompatibilità, e la loro natura non-tossico e il verde-materiale. 3,4 A causa del cannibale e natura velenosa di aracnidi, raccolta sete di ragno attraverso l'agricoltura non è una strategia concreta per soddisfare le esigenze necessarie per la produzione su scala industriale. Pertanto, gli scienziati sono rivolti alla produzione di proteine ricombinanti in seta organismi transgenici in vitro accoppiata con la filatura di fibre sintetiche dalsé proteine purificate. 5-8 Espressione di full-length proteine ricombinanti della seta di ragno è stato tecnicamente difficile, viste le proprietà intrinseche delle sequenze di geni, tra cui la loro natura altamente ripetitiva e lunghezze fisiche (> 15 kb), GC ricco di contenuti e di parte alanina e glicina utilizzo codone. 9-11 Fino ad oggi, la maggior parte dei laboratori si sono concentrati sulla esprimere forme troncate delle principali proteine della seta ampullate MaSp1 o MaSp2 utilizzando sequenze di cDNA parziali o geni sintetici. 12-15 Spinning sintetica ragno sete è un processo impegnativo, che richiede padronanza e conoscenza in diverse discipline scientifiche, e la complessità del processo di filatura non sono state pienamente rivelato al grande pubblico dalla rappresentazione video. In realtà, solo una manciata di laboratori in tutto il mondo hanno la capacità di esprimere i cDNA di seta di ragno, purificare le proteine della seta, fibre sintetiche e girare ad un post-spin pareggio, e infine testare le loro proprietà biomateriale. 8,16,17 Approcci diversi per la filatura delle fibre sintetiche hanno circondato filatura ad umido e secco così come i metodi electrospinning 16,18,19 Tutte le procedure hanno un solo obiettivo in comune -. Sviluppo di un protocollo che produce seta sintetica ragno con proprietà meccaniche che rivali filati naturali per i grandi processi di produzione commerciale.
Qui viene descritta la procedura per generare sete ragno artificiali su scala di laboratorio utilizzando una metodologia di filatura a umido. Rispetto ad altri metodi di filatura, filatura ad umido ha prodotto i risultati più consistenti per l'analisi delle fibre. Si delineano questo inizio procedura con l'espressione delle proteine della seta ricombinanti in batteri, seguito dal loro purificazione, e quindi descrivere le fasi di preparazione di proteine per la filatura, tra cui una post-rotazione metodologia applicata al sorteggio "così come" le fibre filate che produce fili con proprietà dei materiali che si avvicinano la qualità delle sete ragno naturali. Il nostro metodologicoy è progettato per imitare da vicino il processo naturale di filatura di fibre di seta e richiama fortemente sulla nostra esperienza dell'architettura e la funzione delle ghiandole produttrici di seta di orb e COB-tessitura ragni. 20-22 Inoltre, concludiamo con la necessaria procedura per determinare le proprietà del materiale delle fibre sintetiche utilizzando un tensometer per tracciare curve sforzo-deformazione, che consentono investigatori calcolare il carico di rottura, deformazione ultima, e la tenacità delle fibre. Infine, ma di notevole valore, gli apparati di filatura, lo spooling, e il disegno può essere a casa, costruiti utilizzando parti disponibili in commercio, piuttosto che l'acquisto elaborate e costose attrezzature personalizzate.
Protocol
Discussion
Fibre sintetiche filate da questa metodologia sono meccanicamente dello stesso ordine di grandezza rispetto alle fibre naturali. Diminuendo la quantità di errore umano meccanizzare la roccatura e post processi di tiraggio di spin, la variazione tra i campioni sperimentali sono più controllata e notevolmente ridotto.
La nostra metodologia offre la possibilità di studiare le proprietà meccaniche di altre fibre che sono filate dalle proteine ricombinanti codificate dai cDNA di altri m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NSF Grants RUI MCB-0950372 e DMR-1105310 dal titolo "Caratterizzazione molecolare di sete ragno vedova nera e comportamento meccanico di Spider Silks Colla", rispettivamente.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
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