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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Produção de seda sintética Aranha em escala de laboratório

Published: July 18, 2012 doi: 10.3791/4191
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Pacific

Summary

Apesar das propriedades mecânicas excelentes e bioquímicos da aranha sedas, este material não pode ser colhido em grandes quantidades por meios convencionais. Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para produzir fibras de seda de aranha artificial, que é um processo importante para os investigadores que estudam a produção de seda de aranha e sua utilização como a próxima geração de biomateriais.

Abstract

Como a sociedade progride e os recursos se tornam escassos, está se tornando cada vez mais importante para cultivar novas tecnologias que os biomateriais engenheiro de próxima geração com propriedades de alto desempenho. O desenvolvimento destes novos materiais estruturais deve ser rápida, custo-eficiente e envolvem metodologias de processamento e produtos que sejam ecologicamente corretos e sustentáveis. Aranhas giram uma multidão de diferentes tipos de fibra, com diversas propriedades mecânicas, oferecendo uma rica fonte de materiais de engenharia de última geração para biomimicry que rivalizam com os melhores materiais sintéticos e naturais. Como a coleta de grandes quantidades de seda de aranha natural é impraticável, a produção de seda sintética tem a capacidade de fornecer aos cientistas o acesso a um suprimento ilimitado de tópicos. Portanto, se o processo de fiação pode ser simplificado e aperfeiçoado, fibras artificiais de aranha têm o potencial de uso para uma ampla gama de aplicações que vão desde armaduras, sutura cirúrgicas, cordas e cabos, pneus, cordas para instrumentos musicais, e compósitos para a aviação e tecnologia aeroespacial. A fim de avançar o processo de produção de seda e sintéticos para produzir fibras que exibem variação baixa em suas propriedades materiais de rotação para girar, foi desenvolvido um protocolo de extrusão húmida que integra a expressão de proteínas recombinantes de seda de aranha em bactérias, purificação e concentração das proteínas , seguido por extrusão de fibras e um pós-tratamento de spin-mecânico. Esta é a primeira representação visual que revela um processo de passo-a-passo para girar e analisar fibras de seda artificial numa escala de laboratório. Ele também fornece detalhes para minimizar a introdução de variabilidade entre as fibras fiadas a partir da mesma droga de fiação. Coletivamente, estes métodos irá impulsionar o processo de produção de seda artificial, levando a fibras de alta qualidade que superam as sedas naturais de aranhas.

Introduction

A seda da aranha tem extraordinárias propriedades mecânicas que se realiza vários materiais sintéticos, incluindo aço de alta resistência, Kevlar e Nylon. 1 Spiders girar pelo menos 6-7 diferentes tipos de fibras que exibem diversas propriedades mecânicas, cada um projetado com quantidades variadas de resistência à tração e extensibilidade para executar tarefas específicas biológicos. 2 cientistas da pesquisa são rapidamente buscar a utilização de sedas aranha como biomateriais próxima geração devido às suas excelentes propriedades mecânicas, a sua biocompatibilidade, ea sua natureza não-tóxico e verde-de material. 3,4 Devido à canibalista e natureza venenosa de aracnídeos, a colheita sedas de aranhas através da agricultura não é uma estratégia prática para atender as demandas necessárias para a fabricação em escala industrial. Portanto, os cientistas virou-se para a produção de proteínas recombinantes de seda em organismos transgénicos acoplado com in vitro fiação de fibras sintéticas a partir doproteínas purificadas. si só, 5-8 Expressão de full-length proteínas recombinantes de seda de aranha foi tecnicamente difícil, dadas as propriedades intrínsecas de suas seqüências de genes, que incluem sua natureza altamente repetitiva e comprimentos físicos (> 15 kb), GC-rica de conteúdo e tendenciosa alanina e glicina utilização de codões. 9-11 Até à data, a maioria dos laboratórios têm-se centrado na expressão formas truncadas das proteínas principais ampullate seda MaSp1 ou MaSp2 utilizando sequências parciais de cDNA ou genes sintéticos. 12-15 Spinning sintético aranha sedas é um processo difícil que requer domínio e conhecimento em várias disciplinas científicas, e as complexidades do processo de fiação não foram totalmente revelados ao público em geral pela representação de vídeo. Na verdade, apenas um punhado de laboratórios em todo o mundo têm a expertise para expressar os cDNAs de seda de aranha, purificar as proteínas da seda, girar fibras sintéticas e fazer a pós spin-draw, e, finalmente, testar suas propriedades de biomateriais. 8,16,17 diferentes abordagens para fiação de fibras sintéticas abrangidas fiação úmida e seca, bem como métodos electrospinning 16,18,19 Todos os procedimentos têm um objetivo em comum -. Desenvolvimento de um protocolo que produz seda de aranha sintética com propriedades mecânicas que rivais tópicos naturais para grande escala processos de fabrico comercial.

Aqui descrevemos o procedimento para gerar seda de aranha artificial em escala de laboratório usando uma metodologia de extrusão húmida. Em relação a outros métodos girando, girando molhadas tem produzido os resultados mais consistentes para a análise de fibra. Nós delinear este início procedimento com a expressão das proteínas recombinantes de seda em bactérias, seguido por sua purificação, e, em seguida, descrevem os passos de preparação de proteína para a fiação, incluindo uma metodologia draw pós-rotação aplicado à "tal como fiados" fibras que dá o tópicos com propriedades dos materiais que abordam a qualidade da seda de aranha naturais. Nosso METODOLÓGICASy é projetado para imitar o processo natural de fiação de fibras de seda e baseia a nossa experiência da arquitetura e da função das glândulas produtoras de seda do orbe e cob-aranhas tecendo 20-22. Além disso, podemos concluir com o necessário passos para determinar as propriedades do material das fibras sintéticas usando um tensometer para traçar curvas tensão-deformação, que permitem que os investigadores para calcular a resistência à tracção, a estirpe final, tenacidade e de fibras. Por último, mas de valor significativo, os aparelhos de fiação, o spooling e desenho podem ser construídos em casa usando as peças disponíveis no mercado, ao invés de comprar elaborado e caro equipamento personalizado.

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Protocol

A Figura 11
Visão Gráfica: Biomimicry do processo de fiação

Biomimicry do natural via de produção de seda de aranha:. Uma rota para a fabricação de seda sintética Esta imagem mostra a glândula ampullate importante da esfera dourada tecelão, clavipes Nephila, e os componentes utilizados para a produção de seda natural (texto branco). A região da cauda sintetiza grandes quantidades de proteínas de seda, que são transportados para a ampola, uma região de armazenamento para a droga de fiação. Esta droga concentrada é extrudido através da conduta de fiação em que a solução experimenta trocas de iões e desidratação antes da extrusão de fibras. Os processos biomiméticos utilizados no nosso laboratório são indicadas pelo texto vermelho. A produção recombinante de seda é gerada utilizando bactérias transgénicas, seguido de purificação de proteínas utilizando cromatografia. Em seguida, a proteína purificada é subject a liofilização para se concentrar o material. Por último, a proteína é re-dissolvido em HFIP e extrudidas a partir de uma agulha de seringa em um banho de isopropanol.

1. Construção de plasmídeos e Preparação Cultura bacteriana celular

  1. Realizar PCR utilizando os desejados aranha de seda conjuntos de iniciadores de ADNc e específico. Gel-extrair e ligar o cDNA amplificado em um vetor de expressão procariótico por exemplo ThioFusion pBAD / TOPO (Fig. 1A). Este vector tem uma etiqueta tiorredoxina N-terminal para facilitar a solubilização de seda de proteína e um 6x C-terminal His para a purificação de proteínas. Transformar os produtos de ligação em E. competente células de Escherichia.
  2. Seleccionar colónias que contêm o vector de clonagem recombinante e usar uma colónia para inocular 200 ml de LB estéril suplementado com ampicilina (Fig. 1B). Crescer esta cultura durante a noite à saturação, por agitação a 200 rpm num incubador orbital a 37 ° C.
  3. Combine a 200 mL de saturated cultura com 800 mL de cultura LB fresco. Induzir a expressão da proteína de seda aranha durante 4 horas por adição de arabinose 0,2% (w / v). Certifique-se de manter a cultura sob seleção antibiótico.
  4. Sedimentar as células a 16.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C (Fig. 1C). Por simplicidade, pelete todo o volume em um recipiente. Vários passos de centrifugação pode ser necessário, dependendo da capacidade de volume dos tubos de centrifugação. Se necessário, o volume de decantar o líquido após fiação e re-pelete de material adicional para garantir a célula inteira da pelota é em um recipiente. Os sedimentos celulares podem ser armazenadas a -80 ° C até serem necessários.
  5. Antes de descartar os meios de cultura usados, adicionar água sanitária ou autoclave para esterilizar.

2. Lise Celular

  1. Adicionar 20 mL de tampão de lise 1x para a célula de 1 L pelete (Fig. 2A). Certifique-se de ressuspender o pellet celular completamente.
  2. Adicionar lisozima a uma concentração de 1 mg / mL para promover ainda maislise celular. DNase também podem ser adicionados nesta etapa para digerir o DNA cromossómico para ajudar a reduzir a viscosidade da solução. Colocar a amostra num agitador orbital e agite durante 20 min.
  3. Sonicar a solução no máximo durante 1 minuto.
  4. Para clarificar a solução, de centrifugação a 16.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C (Fig. 2B).

3. Protein Purification: Ni-NTA coluna de afinidade Cromatografia

  1. Remover o sobrenadante e transferi-lo para uma coluna de cromatografia limpo de 25 mL. Certifique-se o sobrenadante é não-viscoso e claro. Se a solução é viscosa e turva, adicionar mais ou DNase sonicado e / ou re-pellet o sobrenadante (repita os passos 2,3-2,4).
  2. Adicionar 1 mL de Ni-NTA slurry (0,5 mL pérolas) para a coluna. Firmemente fixar a tampa ea torneira, e, em seguida, ajustado em um balancim a equilibrar durante 1 hora para permitir a ligação do seu 6x-tag para as pérolas de Ni-NTA (Fig. 3A).
  3. Definir a coluna ereta em umarepousar e permitir que as esferas de Ni-NTA de se contentar com aproximadamente 2 minutos. Uma camada de luz azul pode ser visto na parte inferior, quando as contas estão completamente resolvidas.
  4. Retire a tampa e permitir que a solução a fluir através da torneira. Recolher esta solução para análise posterior (Fig. 3B).
  5. Adicionar 20 ml de 1X tampão de lavagem e permitir que os grânulos para resolver. Abrir a torneira e permitir que a solução fluir através dele. Recolher esta solução em quatro alíquotas de 5 ml para análise posterior Nota: volumes de lavagem adicionais podem ser usados ​​para reduzir proteínas contaminantes, no entanto, existe uma possibilidade de uma diminuição na produção de proteína final..
  6. Adicionar 20 ml de 1X tampão de eluição e permitir que a resina assentar. Abrir a torneira e permitir que a solução fluir através dele. Recolher esta solução em quatro alíquotas de 5 ml para análise adicional. Nota: volumes de eluição adicionais podem ser recolhidos a partir da resina Ni-NTA se a eluição não é concluída.
  7. As amostras podem ser armazenados em 4° C ou -80 ° C durante curto ou longo prazo de armazenamento, respectivamente.
  8. Tamanho-fracionar as amostras utilizando SDS-PAGE análise. Visualizar as proteínas com prata ou Brilliant Coomassie Blue R-250 (Fig. 3C). Somente as fracções puras deve ser usado para os passos seguintes. Nota: análise de Western blot pode ser usado para confirmar a identidade da proteína purificada.

4. Diálise e liofilização

  1. Dialisar as amostras contra pelo menos 100x a amostra de volume (utilizar água desionizada) durante 2 dias. Alterar a solução de água a cada 6 horas para remover todos os sais. Nota: O tamanho de peso molecular de corte do tubo de diálise depende do tamanho da proteína de seda recombinante.
  2. Pesar 1,5 mL de seis tubos de microcentrífuga vazias e gravar suas massas. Pode ser útil para pequenos orifícios de punção ou fendas sobre as tampas dos tubos antes da pesagem para liofilização para facilitar a liofilização (Fig. 4A).
  3. After a diálise, a transferência de 1 mL da amostra dialisada em cada um dos 6 pré-pesado microcentrífuga tubos (Fig. 4B). Flash congelar usando azoto líquido e secar as amostras para baixo, usando um secador por congelação (Fig. 4C).
  4. Depois de seco, transferir outro 1 mL de amostra de diálise em cada um dos seis tubos. Repita até que a amostra de diálise inteiro foi secou-se para baixo nos tubos de microcentrífuga.
  5. As amostras liofilizadas podem ser armazenadas a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

5. Fiação Preparação Dope

  1. Pesar cada um dos tubos de microcentrífuga contendo a proteína em pó seco. Subtraia a massa inicial dos tubos vazios para obter massa protéica seca total. Nota: Dependendo do rendimento de proteína, pode ser necessário para purificar material adicional para o processo de fiação.
  2. Calcular o volume de hexafluoroisopropanol (HFIP) a adicionar a cada tubo para se obter 200 mg / mL a 500 mg / mL, ou 20% a 50% peso por volume. Adicionar o discomeu quantidade de HFIP em cada tubo (Fig. 4D). Nota: HFIP é altamente volátil e tóxicos, pipeta cuidadosamente e tampa do tubo o mais rapidamente possível. HFIP devem ser manuseados por debaixo de um capuz de segurança.
  3. Parafilm os tubos e coloque sobre uma cadeira de balanço para a solubilização da proteína. Vórtice e centrifugação, ocasionalmente, para facilitar a solubilização. Isso pode levar até 2 dias.

6. Preparação da seringa e Aparelhos de instalação

  1. Carregar pelo menos 25 uL da droga solubilizada fiação para a seringa. Certifique-se que não existem agregados apresentar-se como pode obstruir a seringa. Nota: Este exemplo é extremamente viscoso, então tome cuidado quando pipetagem.
  2. Empurrar a droga para a frente da seringa verticalmente, a remoção de todas as bolhas de ar (Fig. 5A). Nota: As bolhas de ar criar inconsistências na fibra.
  3. Bloquear a seringa para a bomba. Levantar um copo de 400 ml cheio com 95% até isopropanol para que a ponta da seringaé apenas quebrar a superfície do álcool (Fig. 5B).
  4. Definir a bomba de seringa a 15 uL / ​​min e iniciar o programa. Permitir que a fibra fiada como sentar-se no isopropanol durante 20 minutos para equilibrar totalmente. Nota: Estas fibras podem ainda ser utilizados por MS / MS análise para confirmar a identidade das proteínas nas fibras.

7. Mensagem spin-Draw e Coleta de Amostras

  1. Aplicar fita de dupla face para ambos os lados do pente no dispositivo de spooling. O dispositivo de spooling foi criado a partir de colagem de metal pentes para um paquímetro digital (Fig. 6A). Anexar o dispositivo spooling a um motor (Fig. 6B). Recomendamos spool os tópicos em 2 rpm. Nota: resultado mais rápido taxas de spooling em grandes quantidades de variação de qualidade da fibra e reprodutibilidade.
  2. Utilizando uma pinça suavemente agarrar uma extremidade da fibra e, lentamente, puxá-lo para fora do isopropanol, prendendo-a a borda de um dos braços de pente sobre o êmbolo (Fig. 6C). Os próximos passos deve ser feito sem uma parada para evitar que as fibras de secar.
  3. Ligue o motor e suavemente guiar a fibra para a Nota spooling dispositivo:. Durante spooling, não permitem a fibra para dobrar e empilhar em cima uns dos outros.
  4. Uma vez que o inteiro da fibra é enrolado, separar o carretel do motor e aplicar cola para a extremidade de cada fibra de seda sobre a fita de dupla face (Fig. 6D). Este prende a seda aranha para o aparelho. Nota: Ao aplicar a cola para a fita de dupla face antes de pós-spin desenho, impede que a fibra de escorregar inteiro e permite selectiva alongamento dos segmentos interiores das fibras no interior da pinça braços.
  5. Fixe o carretel para o atuador linear (Fig. 7A). Gravar o tamanho inicial das fibras usando a maxila Note-se que este é o comprimento interno da fibra;. Ele não inclui o comprimento colada e embrulhado around o carretel.
  6. Abaixe o carretel em um banho de 75% isopropanol. Permitir que as fibras a equilibrar durante 10 minutos. Nota: Outras soluções desidratantes podem ser utilizados para o processo de fiação, tal como sulfato de metanol, acetona e de amónio.
  7. Definir a velocidade de actuador linear a 1,5 mm / seg. Com base no comprimento inicial, calcular o comprimento final para a relação de estiramento desejado pós-spin. A quantidade esticado pode ser controlado com base na velocidade ou o comprimento, dependendo da configuração. Por exemplo, com um comprimento inicial de 15 mm e uma relação de estiramento desejado pós-spin de 3x, o comprimento final deve ser de 45 mm. Isto também pode ser calculado como a alimentação do actuador linear durante 20 segundos a uma taxa de 1,5 mm / seg.
  8. Uma vez que o desenho de rotação desejada pós está completa, lentamente elevar o êmbolo para fora do isopropanol. Permitir que as gotículas de isopropanol para secar durante 1 minuto, e, em seguida, recolher amostras (Fig. 7B). As amostras devem ser montados em quadros de cartolina ou papel alumínio para testar purposes.
  9. Se mais razões de pós-tração de spin são desejados, diminuir o carretel de volta para o banho de 75% isopropanol. Permitir que as fibras a equilibrar durante 10 minutos, e então avançar para a próxima relação de estiramento de pós de rotação.

8. Testes de tração

  1. Permitir que as amostras recolhidas para equilibrar para o ambiente de laboratório padrão, pelo menos, 1 hora antes do teste mecânico. A umidade ea temperatura deve ser registrada como eles podem afetar as propriedades mecânicas da fibra. Humidade padrão e condições de temperatura deve ser de aproximadamente 40% e 25 ° C, respectivamente.
  2. Cole as bordas da folha de cartolina ou para proteger a fibra sobre a armação. Tomar nota do tamanho da abertura da moldura. Este é o comprimento inicial da sua fibra testado. Uma armação de abertura de 1 polegada (25,4 mm) é mostrado aqui (Fig. 8A).
  3. Usando um microscópio de luz com uma ampliação de 100x ou maior, tomar medições de diâmetro ao longo do eixo longitudinal da fibra.Pelo menos 3 medidas devem ser registrados. Quanto maior for a ampliação usada e os mais medições tomadas, melhor será a precisão.
  4. Fixe a moldura para um quadro de carga tensometer mecânico (Fig. 8B). Cortar o quadro em ambos os lados de modo a tensão estiver executando apenas através da fibra. Tare tensometer e coletar os dados. Uma taxa de deformação padrão de 2% por segundo é recomendada.
  5. Com os dados recolhidos eo diâmetro médio, uma curva de tensão do estresse podem ser plotados.
  6. A fibra quebrado agora pode ser montado em um microscópio eletrônico de varredura (MEV) stub para análises morfológicas e medidas de quebra de diâmetro ponto. O segmento de fibra para longe do ponto de quebra pode ser utilizada para estimar e verificar o diâmetro inicial medida pelo microscópio de luz.

9. Os resultados representativos

A partir do passo 3, as diferentes fracções devem ser analisados ​​por SDS-PAGE e as proteínas análise visualizado com prataou de Coomassie Brilliant Blue R-250. Partir de um padrão condições de Ni-NTA de coluna, eluição com fracções de pureza> 90% podem ser obtidos (Fig. 9). Pequenas proteínas contaminantes podem ainda ser removido por diálise extensiva. Usando 25 uL de fiação droga a 20% (w / v), pelo menos 30 amostras de fibra separadas podem ser recolhidos a partir da fibra ferida contínua sobre o êmbolo (assume um comprimento inicial de 13 mm é utilizado). As propriedades mecânicas podem ser analisados ​​por meio de testes tensometer (Fig. 10). Dependendo da proteína de seda recombinante usado para o processo de fiação, os máximos pós rácios tração de spin terá de ser determinada empiricamente. Em geral, colocar rotação desenhar proporções de 4,0 x pode ser alcançada sem falha de fibras (Fig. 10). Fibras fiadas, antes ou depois de centrifugação draw pós, podem ser analisadas com um microscópio electrónico de varrimento para visualizar a ultraestrutura (Fig. 11A, B). Fibras fiadas podem também ser utilizados para testes mecânicos, exibindo resultadosque, com baixa variação dentro de um grupo de spin draw pós amostra ratio (Fig. 10).

A Figura 1
Figura 1. Expressão do cDNA de seda de aranha em bactérias. A) O vector pBAD TOPO / Thio contendo o cDNA de seda de aranha de interesse é transformado em E. competente células de Escherichia. B) Uma única colónia é inoculada em 200 ml de LB e cultivadas até à saturação durante a noite. Após a inoculação, 800 mL de LB fresco é adicionado ea cultura é induzida por expressão usando arabinose. C) Após a conclusão da indução, a cultura é sedimentado por centrifugação. Clique aqui para ver maior figura .

A Figura 2
Figura 2. Lise das células bacterianas após a indução da aranha de proteína de seda. A) Vinte milliliters de tampão de lise 1x e DNase é adicionado ao sedimento de células e colocado num agitador orbital e sonicada para lisar as células. B) O lisado celular é girada em uma centrífuga para limpar o sobrenadante de detritos celulares eo sobrenadante é recolhido. para ver figura maior .

A Figura 3
Figura 3. Purificação de proteínas de seda de aranha recombinantes utilizando cromatografia de afinidade. A) A célula lisado sobrenadante e Ni-NTA grânulos são adicionados a uma coluna de cromatografia e incubadas durante 1 hora. B) Após o fluxo contínuo é recolhido, 20 mL de tampão de lavagem e 20 mL de tampão de eluição são utilizados em sequência e recolhido em fracções de 5 ml. C) As fracções diferentes são analisadas por SDS-PAGE, as amostras puras contendo a proteína alvo são transferidos para um saco de diálise e dialisada contra água Dl paraconclusão. Clique aqui para ver maior figura .

A Figura 4
Figura 4. Preparação da proteína de seda de aranha purificado por extrusão húmida. A) O produto dialisado é transferido para tubos de centrífuga de pré-pesadas em alíquotas de 1 mL. B) Os alíquotas de 1 ml são flash congelados com azoto líquido. C) As amostras congeladas são liofilizadas e amostra mais diálise é adicionado. D) A massa seca é calculada e HFIP é adicionado ao pó seco para produzir uma droga a 20% (w / v) de fiação. para ver figura maior .

A Figura 5
Figura 5. A carregar a droga de girar dentro da seringa de vidro para extrusão húmida. A) Mantendo a syrinGE verticalmente, a droga de fiação é empurrada para o topo da coluna de seringa, a remoção de bolhas de ar. B) A seringa carregado está ligado à bomba de seringa e baixada para dentro do banho de 95% de isopropanol de modo a ponta é apenas quebrar a superfície do banho.

A Figura 6
Figura 6. Enroladoras das fibras sintéticas de aranha de seda para um dispositivo feito bobinagem. A) O dispositivo de spooling é construído a partir de um paquímetro digital com anexado de metal pentes. Fita dupla face é aplicada a ambos os lados do pente para prender as extremidades da fibra. B) O êmbolo está ligado ao motor de velocidade lenta usando um grampo de crocodilo. C) A fibra é lentamente retirado do banho de álcool e enrolada em torno da bobina. D) A cola é aplicada à extremidade de cada segmento de fibra para segurá-los no lugar. São mostrados dois diferentes fibras fiadas a partir de proteínas diferentes.

A Figura 7 Figura 7. Pós spin-desenhar das fibras sintéticas usando um aparelho de caseira. A) O dispositivo de spooling está ligado à configuração do actuador linear usando pinças de crocodilo. B) Após uma etapa de compra pós de rotação, o êmbolo é levantada a partir do banho. Gotículas isopropanol estão autorizados a evaporar antes da coleta de fibra.

A Figura 8
Figura 8. De montagem das fibras de seda sintético em uma cartolina para estudos mecânicos. A) Coletados fibras são montados em quadros de cartolina com um "x 1" 1 recorte. As fibras são inicialmente mantidos no lugar com fita dupla face e, em seguida fixada com cola. B) A armação cartolina é fixado sobre uma tensometer. Os lados são então cortadas de modo a tensão estiver executando apenas embora a fibra.

A Figura 9
A Figura 9. Tamanho do fraccionamento de recombinante purificada protei MaSp1n fracções usando análise SDS-PAGE seguido por visualização com coloração com prata. Escada proteína é descrito em kDa. As duas amostras de lavagem mostram uma ligação não específica às pérolas, enquanto as amostras de eluição revelam a necessidade de 6 colecções para assegurar a recuperação de proteína total.

A Figura 10
Figura 10. Curvas de tensão deformação de fibras fiadas de recombinantes TuSp1 proteínas. 8 cores mostram as fibras que foram submetidas a diferentes relações de spin pós empate, variando de 2,5 x para 6x. Fibras mostram uma variação de baixo dentro do seu grupo rácio; como aumento pós rotação rácios tração, a força da fibra é aumentada enquanto extensibilidade é diminuída.

A Figura 11
Figura 11. De digitalização de imagens de microscopia eletrônica de fibras fiadas de recombinantes TuSp1 proteínas. A) A ampliação de 500x, a externa lisasuperfície pode ser visto. B) Em 5000x, o núcleo interior denso pode ser observado a partir de uma quebra natural de fibra.

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Discussion

As fibras sintéticas fiados a partir desta metodologia são mecanicamente sobre a mesma ordem de grandeza em comparação com as fibras naturais. Diminuindo a quantidade de erro humano por mecanização da spooling e processos pós tração de spin, a variação experimental entre as amostras são mais controlada e grandemente reduzida.

A nossa metodologia oferece o potencial para investigar as propriedades mecânicas de outras fibras que são fiados a partir de proteínas recombinantes codificados a partir dos cDNAs de outros membros da família de genes de aranha. Potencialmente, poderia determinar o papel mecânica de módulos de proteínas diferentes dentro de uma fibroína, ou entre os tipos de fibroína diferentes. 23 também permite o teste de fibras de seda como compósitos, como mais do que uma proteína de seda ou outras moléculas podem ser combinados ou adicionados e centrifugada como uma mistura de proteínas.

Esta metodologia de giro é uma plataforma para outros laboratórios facilmente expandir, como a APPAratuses pode ser construído de uma maneira fácil. Isto permite também que para ajustar os parâmetros ao longo de cada passo de optimizar ou personalizar o desenho de fibras específicos com propriedades mecânicas únicas. Como a necessidade de biomateriais verdes para os futuros aumentos, esta metodologia pode ser adaptada para produzir fibras que servem uma variedade de aplicativos de próxima geração.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela NSF RUI Grants MCB-0950372 e 1105310 DMR-intitulado "Caracterização Molecular de Silks aranha viúva negra e comportamento mecânico de Spider Silks cola", respectivamente.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit Invitrogen K370-01
FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x Promega V857C
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210 Includes instructions for buffers
ProteoSilver Silver Stain Kit Sigma-Aldrich PROTSIL1-1KT
FreeZone Lyophilizer Labconco 7960041 FreeZone 12Plus
Hexafluoroisopropanol (HFIP) Sigma-Aldrich 52512
Syringe Hamilton 7657-01 250 μL
Needle Hamilton 7780-01 26s Gauge, Blunt end removable needle
Syringe Pump Harvard Apparatus 702208 11Plus
Digital Caliper Carrera CP5906 0-150 mm range
Stainless steel forceps World Precision Instruments 501764 Mini Dumont #M5S
Motor Nature Mill 7090529 12VDC, 2 rpm speed
Linear Actuator Warner Electric 01-D024-0050-A06-LP-IP65 24VDC, 6 inch range
Dissecting microscope Leica Microsystems Leica MZ16
Digital microscope camera Leica Microsystems DFC320 Software: Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors World Precision Instruments 500260
Microtensometer Aurora Scientific 310C 5N Dual-Mode System

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References

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Hsia, Y., Gnesa, E., Pacheco, R., Kohler, K., Jeffery, F., Vierra, C. Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale. J. Vis. Exp. (65), e4191, doi:10.3791/4191 (2012).

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