Syntetisk Spider Silk Production i laboratorieskala
Summary
Trots de enastående mekaniska och biokemiska egenskaper hos spindel siden, kan detta material inte tas ut i stora mängder med konventionella medel. Här beskriver vi en effektiv strategi för att snurra regenatfibrer spindeltråd, vilket är en viktig process för utredarna studerar spindeltråd produktion och deras användning som nästa generations biomaterial.
Abstract
As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.
Introduction
Spider silk har extraordinära mekaniska egenskaper som anges utför flera konstgjorda material, inklusive höghållfast stål, Kevlar och nylon. 1 Spindlar spinner minst 6-7 olika fibertyper som visar olika mekaniska egenskaper, var utformade med varierande mängder av draghållfasthet och utbyggbarhet för att utföra specifika biologiska uppgifter. 2 Forskare snabbt vidare med användningen av spindel silke som nästa generations biomaterial på grund av deras utmärkta mekaniska egenskaper, biokompatibilitet och deras icke-toxiska och grön-materiell natur. 3,4 grund av kannibalistiska och giftig art spindeldjur, skörd spindel silke genom jordbruk är inte en praktisk strategi för att möta de krav som är nödvändiga för industriell skala tillverkning. Därför har forskare visat att produktionen av rekombinanta silke proteiner i transgena organismer i kombination med in vitro-spinning av syntetiska fibrer från dense-renade proteiner. 5-8 Redovisning av full längd rekombinanta proteiner spindeltråd har varit tekniskt svårt med tanke på de inneboende egenskaperna hos sina gensekvenser, som omfattar deras mycket repetitiv karaktär och fysiska längd (> 15 kb), GC-rikt innehåll och partiska alanin och glycin kodonanvändning. 9-11 Hittills har de flesta laboratorier fokuserat på att uttrycka trunkerade former av de stora proteinerna ampullate siden MaSp1 eller MaSp2 med partiella cDNA-sekvenser eller syntetiska gener. 12-15 Spinning syntetiskt spindel silke är en utmanande process som kräver mästerskap och kunskap inom flera vetenskapliga discipliner, och krångligheter i spinning processen har inte helt avslöjas för allmänheten genom video representation. Faktum är att endast en handfull laboratorier över hela världen har kompetens att uttrycka spindeltråd cDNA, rena silkesproteiner, snurra syntetiska fibrer och utföra post-spin drag, och sedan slutligen testa sina biomaterial egenskaper. 8,16,17 Olika metoder för spinning syntetiska fibrer har omfattat vått och torrt spinning samt electrospinning metoder 16,18,19 Alla förfaranden har ett mål gemensamt -. Utveckling av ett protokoll som producerar syntetiska spindeltråd med mekaniska egenskaper som konkurrerande naturliga ämnen för storskaliga kommersiella tillverkningsförfaranden.
Här beskriver vi proceduren för att skapa konstgjorda spider sidentyger i laboratorieskala med en våtspinning metod. I förhållande till andra spinning metoder har våtspinning gett de mest konsekventa resultaten för fiber analys. Redogör vi för detta förfarande börjar med expression av de rekombinanta silkesproteiner i bakterier, följt av deras rening, och sedan beskriva de olika stegen protein förberedelse för spinning, inklusive en post-spin drag metod som tillämpas på "as-spunna" fibrer som ger trådar med materialegenskaper som närmar sig kvaliteten av naturliga spindel silke. Vår methodology är utformad för att efterlikna den naturliga snurrande processen siden fibrer och den drar starkt på vår expertis arkitektur och funktion silk-producerande körtlar från klot-och Cob-vävning spindlar. 20-22 Dessutom avslutar vi med de nödvändiga steg för att bestämma de väsentliga egenskaperna hos syntetfibrer med användning av en tensometer att plotta spännings-töjningskurvor, som tillåter forskare att beräkna den slutliga hållfasthet, ultimat töjning och seghet av fibrer. Sist men av betydande värde, kan de spinning, buffra, och rita apparater vara hemma-byggd med kommersiellt tillgängliga delar, snarare än att köpa kostsamma anpassad utrustning.
Protocol
Discussion
Syntetiska fibrer spunna av denna metod är mekaniskt på samma storleksordning jämfört med den naturliga fibrer. Genom att minska mängden mänskliga fel genom mekanisering av buffring och efter spin processer rita, den experimentella variationen mellan prover är mer kontrollerad och kraftigt reducerad.
Vår metodik ger möjlighet att undersöka de mekaniska egenskaperna hos andra fibrer som är spunna från rekombinanta proteiner som kodas från cDNA andra medlemmar av spider genfamilj….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NSF RUI Grants MCB-0950372 och DMR-1105310 titeln "Molecular Characterization of Black Silks änka, maskin-och beteende Spider Lim Silks," respektive.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. . Biology of spiders. , (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. . Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C., Cuppoletti, J. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. 2, 303-324 (2011).
