Summary
Här beskriver vi ett nytt high-halt kemiskt inducerad inflammation analys som syftar till att identifiera immun-modulerande bioaktiva substanser. Vi har framgångsrikt kombinerat automatiserad mikroskopering med egna utvecklade program skript som gör det möjligt automatisk kvantifiering av det inflammatoriska svaret samt ytterligare databehandling, analys, gruvdrift och lagring.
Abstract
Zebrafisk larver är särskilt mottagliga för hela djuret liten molekyl skärmar 1,2 på grund av deras ringa storlek och relativt enkel manipulation och observation, liksom det faktum att föreningar enkelt kan läggas till badvatten och lätt absorberas när de administreras på ett <1% DMSO-lösning. På grund av den optiska klarheten hos zebrafisk larver och tillgängligheten av transgena linjer som uttrycker fluorescerande proteiner i leukocyter, zebrafisk erbjuda den unika fördelen att övervaka en akut inflammatorisk respons in vivo. Följaktligen har utnyttja zebrafisk för hög-innehåll små molekyler skärmar som syftar till att identifiera immun-modulerande föreningar med hög genomströmning föreslås 3-6, vilket tyder på inflammation induktion scenarier t.ex. lokala hack i Finland vävnad, laserskada riktad mot gulan yta embryon 7 eller tailfin amputation 3,5,6. Den största nackdelen med dessa metoder var emellertidKravet på manuell manipulering larv att inducera sårskada, vilket förhindrar högkapacitetsavsökning. Introduktion av kemiskt inducerad inflammation (Chin) analys 8 elimineras dessa hinder. Eftersom såra tillfogas kemiskt antalet embryon som kan behandlas samtidigt är praktiskt taget obegränsat. Tillfällig behandling av zebrafisk larver med kopparsulfat inducerar selektivt celldöd i hårcellerna i sidolinjen systemet och resulterar i snabb granulocyt rekrytering till skadade neuromasts. Det inflammatoriska svaret kan följas i realtid med hjälp av föreningen transgena cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 6,9 zebrafisk larver som uttrycker en grön fluorescerande protein i neuromast celler, såväl som en röd fluorescerande protein granulocyter märkning.
För att utarbeta en screening strategi som skulle möjliggöra både hög-innehåll och hög genomströmning analyser vi infört robot vätskehantering och kombinerade automatiserade MICRoscopy med ett utvecklat egen programvara för script. Detta skript möjliggör automatisk kvantifiering av det inflammatoriska svaret genom att göra poäng i procent som upptas av fluorescerande röda leukocyter inom ett empiriskt definierat område som omger skadade gröna fluorescerande neuromasts. Dessutom har vi automatisk databehandling, hantering, visualisering och lagring baserat allt på egen utvecklade MATLAB och Python-skript.
I korthet presenterar vi en automatiserad HC / HT-skärm som gör att testning av kemiska föreningar för sin effekt på initiering, progression eller upplösning av en granulocytisk inflammatoriskt svar. Protokollet syftar en bra utgångspunkt för mer djupgående analyser av läkemedel mekanismer och vägar är involverade i orkestrering av en medfödd immunsvar. I framtiden kan det hjälpa att identifiera oacceptabla toxiska eller utanför mål effekter vid tidigare faser av läkemedelsutveckling och därmed minska processuella risker och kostnader för läkemedelsutveckling.
Protocol
1. Djurhantering
För Chin analysen användning 3 dpf larver som härrör från gruppen parningar mellan homozygot dubbelt transgena cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 och AB (vildtyp) fisk. Samla embryon genom naturlig lek och höja dem vid 29 ° C i E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, och 0,1% metylenblått, ekvilibrerad till pH 7,0) i petriskålar. Det är viktigt att upprätthålla en densitet av embryon som inte överstiger 50-70 per platta.
2. Larva Sortering
Kontrollera alla larver under en fluorescens stereoskop för lysrör reporter uttryck, spontana inflammation och lämplig åldersrelaterade utveckling.
3. Screening Medium Preparation (alltid förbereda färsk)
Framställ E3 medium utan metylenblått kompletterat med DMSO (1% slutlig) och MS222 (0,05 g / l).
4. CuSO4Beredning (alltid förbereda färsk)
Väg först upp ur CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) och förbereda en 20 mM stamlösning i dH 2 O. Framställ 120 pM CUSO4 arbetslösning (från 20 mM stamlösning) i E3/DMSO (1%) / MS-222. Skydda CuSO 4 lösning från ljus.
5. 384-brunnsplatta Framställning (Greiner 384 brunnars mikroplatta)
Pre-tillsätt 20 pl av E3/DMSO (1%) / MS-222 till varje brunn med en omvänd pipett. En ökad pipettspets hål krävs för att hantera de embryon försiktigt utan att tillfoga något sårande, detta gör du genom att skära spetsen till en 2 mm hål. Överföra enstaka larv i 74 | il medium till varje brunn (84 pl för obehandlad kontroll). Om det behövs, orientera larver i en lateral position inom brunnen med hjälp av en flexibel Eppendorf Microloader pipettspets (Eppendorf, 5242 956,003).
Sköta alla följande flytande hantering steg med en robot flytandehantering arbetsstation för att samtidig behandling av alla larver.
6. Läkemedelsbehandling
Blanda föreningarna i läkemedel lager plattan 5 gånger genom pipettering upp och ned. Tillsätt 16 pl av 7,5 x läkemedlet lager plattan till varje brunn och blandas 5 gånger. Justera tips position inom brunnar för att förhindra skador av larver och fördela mediet vid 10 pl / s. Blanda mediet i brunnar 4 gånger för att säkerställa homogen fördelning av läkemedlet i brunnen.
7. Inkubation
Inkubera skärmplåt under 1 h vid 29 ° C täcktes med aluminiumfolie för att skydda föreningar såväl som CuSO 4 från ljus.
8. Kemisk sårbildning
Tillsätt 10 pl av 120 pM CUSO4 arbetslösning till varje brunn förutom med negativa kontroller, blanda 4 gånger och inkuberas åter under 1 h vid 29 ° C.
9. Tvättning
Ta bort och byta 80 pl av mig dium från varje brunn två gånger (i 20 pl steg) för att avlägsna föreningar och CUSO4.
10. Bild Acquisition
Start bilder förvärv på ett inverterat automatiserat mikroskop (dvs. Olympus scan till ^ R) 90 minuter efter första koppar behandling. Ställ in initial z-nivå så att neuromasts från höger och vänster bakre tvärgående linjen är synliga. Bild varje brunn en gång per timme i kanalerna brightfield, Cy3 och GFP i 4 fokalplan (50 | im avstånd) med användning av ett 4x objektiv (NA = 0,13).
Ytterligare information om bild-och databehandling finns tillgängliga på begäran.
11. Bildbehandling
1. Datasortering
Raw Bilderna bearbetas med våra kunder LabView program script. Den första operationen i bildbehandling rörledningen sortering av RAW-bilder från den genererade mikroskopet Data-mappen efter kanal, väl och tid-punkt information.
ove_step "> 2. Utökad fokusDärefter programmet skapar utökat fokus bilder från 4 fokalplan för varje kanal.
3. RGB-overlay
I ett sista steg de utökade fokus bilder från de 3 kanalerna slås samman för att resultera i en slutlig RGB-overlay bild.
4. Automatiserad neuromast detektering
En mönsterigenkänning verktyg (LabView Rapid prototyping IA verktyg) identifierar neuromasts inom RGB overlay bilderna och skapar en empiriskt definierat område av intresse runt neuromasts.
5. Kvantifiering
Inom det empiriskt avgränsat intresse kring skadade neuromasts fluorescerande röda leukocyter (återspeglas som röda pixlar) poängsätts resulterar i en primär avläsning av p ercent en rea o ccupied med l eukocytes (Paol). I genomsnitt 95,27 ± 2,11% (FDA1) och 95,12 ±1,56% (FDA2) av brunnar (larver) har upptäckts korrekt och har därefter genomgått ytterligare databehandling. Den råa datautgång (Paol för varje detekterad neuromast) lagras i en txt-fil och fungerar som indata för MATLAB skript som behandlar rådata ytterligare.
12. Data Processing
1. Imaps
Bedömning av framgång enskilda experiment med grafisk visualisering av den råa utdata Paol i en färgkod kan realiseras med så kallade inflammation kartor (imaps) (Figur 2). Klargrön återspeglar en hög initial inflammatorisk index, svart indikerar ingen inflammation. Denna snabb överblick möjliggör snabb identifiering av misslyckade experiment, som sedan kan uteslutas från vidare dataanalyser.
2. Genomsnitt av kontroller
Varje experimentell platta innehåller 320 föreningar återspeglar enenda datapunkt per förening och tid-punkt samt 32 positiva och negativa kontroller. Den 32 kontrollen replikerar beräknas och standardavvikelse beräknas. För de kontroller enda datapunkterna inom 2 standardavvikelser ingår.
3. Normalisering
Normalisering görs av kalkylark analys. Det genomsnittliga värdet av DMSO, som är den negativa kontrollen är satt till 0 och den högsta genomsnittliga Paol för koppar kontrollen är satt till 1, så att den maximala skillnaden mellan positiv och negativ kontroll sätts till 1. Varje förening har Paol linjärt interpolerad eller extrapoleras till respektive kontrollerna på den experimentella plattan.
4. Final läste ut: Inflammatorisk index
Efter det att tillräckliga upprepade experiment (dvs 15) har utförts, är normaliserade rådata från upprepade experiment genomsnitt, vilket resulterar i en slutlig avläsning - den inflammatoriskaindex. Den initiala inflammatoriska index koppar kontrollen börjar vid 100% för tid punkten noll och korrelerar till bild förvärvet starttid (90 minuter efter initial koppar behandling).
5. Monoton exponentiell regression montering
På grund av inflammation upplösning över tiden genomför vi en monoton exponentiell icke-linjär regression passar mot det initiala inflammationen med hjälp av 
- En 0 är ett mått på den initiala responsen vid t = 0, är en 1 relaterad till lutningen på storleken över tiden.
6. 2-D-funktionen utrymmet kurva (Fig. 4)
Att generera funktionen utrymme, är en icke-linjär regression appliceras och en grupp-analys uppdelar funktionen utrymmet in karakteristiska regioner, vilket möjliggör automatisk identifiering av intressanta kandidater från olika immun-modulatoriska kategorier (anti-inflammatCDG, anti-upplösning, pro-inflammatorisk, pro-upplösning). Alla föreningar visas i den 2-D-kurva baserad på parametrarna a 0 och en 1.
13. Datahantering och lagring
Våra data hantering rutiner skapar webbsidor för att visualisera och representera sådana läkemedel skärmar som ger en snabb överblick över bilden och databehandling steg resultat samt en detaljerad bild när så begärs av användaren 10. Mjuka länkar till andra relevanta heterogena biologiska och kemiska databaser är integrerade samt ge en värdefull resurs för jämförande och nya studier 11. Genom dessa rutiner är lämpliga uppgifter normer och metainformation in för långtidslagring av dessa uppgifter.
14. Representativa resultat
I en pilot-skärm vi analyserat ett bibliotek bestående av 640 FDA godkänt kända bioaktiva föreningar för effekter på initiering, progression eller upplösning av en granulocytic inflammatoriskt svar. Baserat på de observerade effekter vi klassificerade 4 typer av immun modulerande fenotyper som kan tyda på olika typer av åtgärder: anti-inflammatoriska (1), anti-resolution (2), pro-inflammatoriska (3) och pro-resolution (4) , som kan beskrivas med de parametrar en 0 och en 1, som uppstår när ett monotont icke-linjär regression montering (e ao + ALX -) mot den ursprungliga inflammationen. En 0 representerar storleken av det inflammatoriska svaret medan en 1 kännetecknar lutningen på kurvan och därmed beskriver inflammation upplösning. Visar alla föreningar i en 2-D-funktionen rymden plot (en 1 vs en 0) möjliggör automatisk identifiering av drabbade kandidater från de olika immun modulerande kategorierna (Figur 3).
45 av 640 föreningar utövas signifikant antiinflammatorisk effekt genom att minska den initiala inflammatoriska index till 50% eller mindre. Inom thiar kategorin Vi hittade 6 föreningar som hör till den farmakologiska klass av icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID), som bekräftar giltigheten av vår strategi. Men rankas NSAID inte bland de mest potenta anti-inflammatoriska läkemedel. Förutom de NSAID fann vi flera andra farmakologiska läkemedel klasser såsom exempelvis angiotensinreceptorblockerare (ARB), antibiotika och protonpumpshämmare.
7 föreningar träffade empiriskt fastställd tröskel kriterier för potentiella pro-upplösning läkemedel.
18 läkemedel utövade en pro-inflammatorisk effekt, vilket resulterar i överdrivet leukocytrekrytering till skadade neuromasts jämfört med de positiva kontrollerna.
Endast 2 föreningar förhindrade snabb lösning av det inflammatoriska svaret.
Den anti-inflammatorisk effekt av flera drabbade kandidater (exemplariska kandidater från ovan nämnda farmakologiska läkemedel klasser) från piloten skärmen Could bekräftas på ett dos-beroende sätt i efterföljande sekundära Chin-analyser (data ej visade). Omprovning av 4 möjliga pro-upplösning läkemedel inte bekräfta angivna verkningssätt som utövas i den primära skärmen. 2 av läkemedlen hade en lätt antiinflammatorisk potentialen vid högre koncentrationer (20 nM). En tredje läkemedel uppvisade en marginell icke-dosberoende anti-inflammatorisk effekt vid läkemedelskoncentrationer som sträcker från 5 till 20 | iM. Den fjärde läkemedlet hade ingen effekt på den inflammatoriska responsen vid de testade koncentrationerna.
Figur 1. Arbetsflöde av hakan analysen. Individuella föreningen transgen cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larver (3 dpf) är manuellt fördelade i 384-brunnars mikrotiterplattor. Läkemedel tillsätts samtidigt till varje brunn med en Zephyr Compact Workstation Liquid Handling. Analysbetingelser Plattorna inkuberas därefter under 1 h vid 29 ° C. Behandling med CUSO4
Figur 2. . Översiktlig bild av råbilder Figuren visar råa bilder av 4 fokalplan (Z = 0 - 3) på ett avstånd av 50 nm i kanalerna Cy3 (vänster) och GFP (höger), respektive. Pilar (Z = 1,2) indikerar exemplariska neuromasts och pilspetsar (Z = 1,2) pekar klustrade leukocyter runt neuromasts.
Figur 3. Inflammation kartor (imaps) Framgången av enskilda experiment kan bedömas i imaps återspeglar det inflammatoriska svaret (rådata) i en färgkod. Klargrön speglar en hög initial inflationen mmatory svar, svart indikerar ingen inflammation imaps vid tidpunkt 0 (vänster) och tid-punkt 5 (höger) visar tydligt huruvida ett experiment bör ingå i vidare databehandling.. Koppar kontroller (rad 13 och 24) dyker upp i olika nyanser av grönt, medan DMSO kontrollbrunnar (rad 1 och 12) visas i mörkgrön eller svart. Vid tiden punkt 5 inflammation nästan löst i koppar kontroller, nu anges i mörka nyanser av grönt eller svart. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. 2-D-funktionen utrymme plot av 320 föreningar med en FDA-godkänd bibliotek och deras respektive kontroller. Alla föreningar brunnar kan visas i ett 2-D-funktionen utrymme kurva baserad på parametrarna a 0 och en 1, som uppstår från en icke-linjär regression montering (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" ekvation 1 "/>) mot den första inflammationen. Denna funktion utrymme tomten medger automatiserad identifiering av intressanta kandidater som tillhör ett av följande 4 immun-modulerande kategorier som kan vara ett tecken på droger "verkningsmekanism. anti-inflammatorisk (1), anti-resolution (2), pro-inflammatoriska (3) och pro-resolution (4) Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethyl sulphoxide | Carl Roth GmbH Co KG | A994.2 | |
| Copper(II) sulphate anhydrous | Carl Roth GmbH Co KG | PO23.1 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 384 microwell plate Non-binding, μClear | Greiner | 781906 | black |
| Olympus scan^R | Olympus | ||
| Zephyr Compact Liquid Handling Workstation | Caliper |
References
- Peterson, R. T., Fishman, M. C. Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish. Methods Cell Biol. 76, (2004).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).
- Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish. J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).
- Martin, J. S., Renshaw, S. A. Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease. Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish. BMC Biol. 8, 151 (2010).
- Haas, P., Gilmour, D. Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line. Dev Cell. 10, 673-680 (2006).
- Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge. Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).
- Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. Harvester': a fast meta search engine of human protein resources. Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).
