Summary
En hidtil ukendt rettet evolution metode specifikt til området for termostabilitet teknik blev udviklet og dermed valideret til bakteriolytiske enzymer. Efter kun en runde af vilkårlig mutagenese, en udviklet bakteriolytisk enzym, PlyC 29C3, viste større end to gange den tilbageværende aktivitet sammenlignet med vildtypeproteinet efter forhøjet temperatur inkubering.
Abstract
Dirigeret evolution er defineret som en fremgangsmåde til at udnytte naturlig udvælgelse med henblik på at konstruere proteiner at opnå særlige egenskaber, der ikke er forbundet med proteinet i naturen. Litteratur har givet talrige eksempler vedrørende gennemførelsen af instrueret evolution at kunne ændre molekylær specificitet og katalyse 1. Den primære fordel ved at udnytte rettet evolution i stedet for mere rationel tilgang til molekylær teknik vedrører omfanget og mangfoldigheden af varianter, der kan screenes 2. En mulig anvendelse af dirigeret evolution involverer forbedring strukturelle stabilitet af bakteriolytiske enzymer, såsom endolysins. Bakteriofag kode og udtrykke endolysins at hydrolysere en kritisk covalent binding i peptidoglycan (dvs. cellevæg) af bakterier, hvilket resulterer i værtscelle lysering og frigivelse af afkom-virion'er. Især disse enzymer besidder evnen til at extrinsically inducere lysis at susceptenelig bakterier i fravær af fag og desuden er blevet valideret både in vitro og in vivo for deres terapeutiske potentiale 3-5. Emnet for vores rettet evolution undersøgelse involverer PlyC endolysin, som er sammensat af PlyCA og PlyCB subunits 6. Når oprenset og tilsættes extrinsically, den PlyC holoenzym lyserer gruppe A streptokokker (GAS) samt andre streptokok-grupper i løbet af sekunder og desuden er blevet valideret in vivo mod GAS 7. Betydeligt, overvågning resterende enzymkinetik efter forhøjet temperatur inkubering giver tydelig bevis for, at PlyC mister lytisk aktivitet brat ved 45 ° C, hvilket tyder på en kort terapeutisk holdbarhed, som kan begrænse yderligere udvikling af dette enzym. Yderligere undersøgelser afslører manglen på termisk stabilitet kun observeret for PlyCA underenheden, hvorimod PlyCB underenheden er stabil op til ~ 90 ° C (unpublished observation). Foruden PlyC er der ereveral eksempler i litteraturen, der beskriver den termolabile karakter endolysins. For eksempel mister Staphylococcus aureus endolysin LysK og Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 og Pal aktivitet spontant ved 42 ° C, 43,5 ° C og 50,2 ° C, henholdsvis 8-10. Ifølge Arrhenius-ligningen, som udtrykker sammenhængen mellem hastigheden af en kemisk reaktion på temperaturen stede i det specielle system, vil en forøgelse i termostabilitet korrelere med en forøgelse af holdbarheden forventede 11. Til den ende er rettet evolution vist sig at være et nyttigt værktøj til at ændre den termiske aktivitet af forskellige molekyler i naturen, men aldrig har denne særlige teknologi blevet udnyttet med succes til undersøgelse af bakteriolytiske enzymer. Ligeledes succesfulde regnskab skrider den strukturelle stabilitet af denne særlige klasse af antibiotika helt er ikke-eksisterende. I denne video, beskæftiger vi en ny metode, der bruger en fejl-pren DNA-polymerase efterfulgt af en optimeret screeningsproces ved anvendelse af en 96-brønds mikrotiterplade-format til at identificere mutationer til PlyCA underenheden af PlyC streptokok endolysin, der korrelerer med en forøgelse af enzym kinetisk stabilitet (figur 1). Resultater efter én runde af tilfældig mutagenese antyder den metode genererer PlyC varianter som bevarer mere end to gange den resterende aktivitet i sammenligning med vildtype (WT) PlyC efter forhøjet temperatur behandling.
Protocol
1. Bestemmelse Optimale Varme Betingelser
Først må man eksperimentelt bestemme den optimale inkubationstemperatur og tid der skal bruges til opvarmningstrinnet i assayet. For vores PlyC model, er det vigtigt at bemærke, at E. coli cotransformeret med plyCA og plyCB generne på separate ekspressionsplasmider er blevet vist at danne et fuldt funktionelt PlyC holoenzym 6. Den 96-brønds mikrotiterplade præparat samt cellevækst betingelser og den efterfølgende replikaudpladning teknik blev tilpasset fra eksemplerne i litteraturen 12-16. En inkubationstid på 30 minutter vil være egnet til dette assay som resultater fra tidligere varmeinaktiveringskinetik eksperimenter dikterer et hurtigt tab af aktivitet under kortvarig inkubering i miljøer end fysiologisk temperatur (upubliceret observation). Den optimale inkubationstemperatur for PlyC blev belyst ved de følgende trin:
- Transform ekspressionskonstruktionen pBAD24: plyCA (Amp r) ind i kompetente E. coli-stamme DH5a pBAD33: plyCB (Cm r).
- Plade transformanterne på en Luria-Bertani (LB) agar plade supplementeret med ampicillin (100 ug / ml) og chloramphenicol (35 ug / ml). Inkubér pladerne natten over ved 37 ° C.
- Med en steril tandstikker, en individuel koloni inokulere i hver række af brønde (figur 2a) i en steril, klar, fladbundede 96 brønde, låg mikrotiterplade, der indeholder 200 pi LB suppleret med ampicillin og chloramphenicol.
- Sikkert placere mikrotiterplade med 96 brønde på en 37 ° C rysteinkubator og dyrke bakterierne natten over ved 300 rpm.
- Hente det 96-brønds mikrotiterplade fra 37 ° C rysteinkubator og replika plade til en ny mikrotiterplade med 96 brønde som følger:
- Tilsættes 180 ul LB suppleret med ampicillin og chloramphenicoltil hver brønd af replika plade.
- Overfør 20 pi af bakterier fra den oprindelige plade til de tilsvarende brønde i replika pladen. Dette bør resultere i en initial OD 600 af ~ 0,5.
- Sikkert placere replika pladen på 37 ° C rysteinkubator og inkubere pladen i 1 time ved 300 opm, tilsæt derefter inductant. I tilfælde af de pBAD ekspressionssystemer, er inductant 0,25% arabinose. Andre ekspressionssystemer kan kræve forskellige inductants. Pladen tilbage på 37 ° C rysteinkubator og rystes ved 300 rpm i yderligere 4 timer for at give mulighed for proteinekspression. Ekspressionsniveauer typisk ligge mellem 10-20 ug PlyC.
- Når proteinekspression har konkluderet, hente replika plade og pelletere bakterierne ved at anbringe 96-brønds mikrotiterplade i en kølecentrifuge der indeholder en svingende-rotor, der passer til mikrotiterplader med 96 brønde. Der centrifugeres ved 3.000 rpm i 10 min ved stuetemperatur.
- Fjern medierne supernatanten ved langsomt at vende mikrotiterpladen og forsigtigt dekantering af medierne.
- Lysere cellerne ved tilsætning af 50 ul B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent til hver brønd. Inkubér pladen ved stuetemperatur i 20 min.
- Øge mængden i hver brønd til 120 gl ved tilsætning af 70 pi phosphatpufret saltvand (PBS) pH 7,2.
- Pelletering af uopløselige cellerester ved centrifugering af pladen ved 3000 rpm i 10 min ved 4 ° C i kølecentrifuge.
- Overfør 110 ul af opløselige rålysat til de tilsvarende brønde i en 96-brønds plade thermocycler.
- Brug 30 minutter som den forudbestemte inkubationstid, udsætter de opløselige lysater øjeblikket er bosiddende i 96-brønds thermocycler plade til en bred gradient temperaturområde spænder 15-20 ° C. Bemærk, at målet er at bestemme ved hvilken temperatur et bestemt enzym mister> 95% katalytisk aktivitet.
- Efter inkubation inkuberes i 96-brøndsthermocycler pladen ved 4 ° C i 5 minutter og overføre 100 ul af de opløselige lysater fra 96 brønde thermocycler plade til deres tilsvarende brønd placering i den endelige mikrotiterplade med 96 brønde.
- Med en 12-kanals multipipettor, tilsættes 100 pi af GAS-stamme D471 til hver brønd. Bemærk, er D471-celler oprindeligt lyofiliseret fra overnatskulturer og resuspenderet med PBS pH 7,2 til opnåelse af en OD600 på ~ 2,0.
- Anbringes straks plade med 96 brønde i mikropladen spektrofotometer og overvåge de enzymkinetik ved måling af OD600 hvert 15. sekund i 20 minutter. Den laveste temperatur inkubering der svarede til brønde, der manglede en ændring i optisk densitet (AOD ≤ 0,1) defineres som den ikke-tilladende temperatur.
Efter et bredt temperaturområde skærm udføres for at identificere den ikke-tilladende temperatur, kan de ovennævnte trin gentages over et mere snævert område af temperaturer (5 ° -10 ° C) at belyseDen nøjagtige ikke-tilladende temperatur for enzymet af interesse. Bemærk, kan den ikke-tilladende temperatur identificeret i dette assay være anderledes end smeltetemperaturen belyst med andre midler som følge af forskelle i mængde, koncentration, etc.
2. Frembringelse af mutantbibliotek
Oprettelsen af den mutantbibliotek skal screenes indebærer tilfældigt inkorporere mutationer ved en fejlbehæftet DNA-polymerase med minimal nukleotid bias i plyCA genet ved hjælp af GeneMorph II tilfældig mutagenese Kit som følger:
- Designe nucleotidprimere med lignende smeltetemperaturer (T m) mellem 55 til 72 ° C med restriktionsstederne af valg ved 5'-og 3'-enderne af plyCA genet.
- Da den ønskede mutation rate er 2-3 nukleotider pr plyCA (1,4 kb), bruge PCR-reaktionsprodukterne komponent koncentrationer samt thermocycler betingelser anbefalet af fabrikanten for lave mutation frequencies (0-4,5 per kb).
- Klone de mutageniserede plyCA gener i ekspressionsvektoren pBAD24.
- Omdanne konstruktioner i en DH5a pBAD33: plyCB baggrund og plade transformanter på LB-agar plader suppleret med ampicillin og chloramphenicol.
- Derudover transformere og plade DH5a pBAD33: plyCB med ekspressionsvektoren pBAD24 indeholdende WT plyCA genet. Kolonier fra denne plade vil tjene som kontrol under screening.
3. 96-brønds mikrotiterplade Fremstilling og cellevækst Betingelser
- Fyld hver brønd i en mikrotiterplade med 96 brønde med 200 pi LB suppleret med ampicillin og chloramphenicol.
- Efter mikrotiterpladen skematisk (figur 2b), med omhu en individuel koloni fra overnight agarplader med en steriliseret tandstikker og podning af bakterierne i den angivne brønd i 96-brønds mikrotiter-PLAte. Det er vigtigt at sikre, at kun en koloni per brønd podes.
- Ryst sikkert forankret mikrotiterplade med 96 brønde ved 300 rpm natten over ved 37 ° C.
4. Replikaudpladning, Protein Expression Induktion og Lysate Forberedelse
- Følg trin 1,5-1,11 fra afsnittet "Bestemmelse af de optimale opvarmningsbetingelser" med en modifikation. Gemme den originale plade ved 4 ° C efter replika-udpladning trin er afsluttet.
- Efter trin 1.11, transfer 110 ul af opløselige rålysat til de tilsvarende brønde i en 96-brønds thermocycler pladen undtagen den positive kontrolbrønde A1-D1. Med hensyn til de positive kontrolprøver lysaterne (dvs. lysater, der ikke opvarmes), transfer 100 ul lysaterne til de tilsvarende brønde i en ny mikrotiterplade med 96 brønde, som vil tjene som det endelige assay plade for eksperimentet og opbevares på is.
5. Opløseligt Lysate Varmebehandling
- Opvarme den negative kontrol og mutant opløselige lysater øjeblikket begrænset i 96-brønds thermocycler plade i termocykler i 30 minutter ved den optimerede ikke-tilladende inkubationstemperatur bestemt i trin 1..
- Efter ikke-tilladende temperatur inkubation inkuberes i 96-brønds thermocycler pladen ved 4 ° C i 5 minutter.
- Overfør 100 gl af de opløselige lysater fra 96 brønde thermocycler plade til deres identiske og steder i det endelige 96-brønds mikrotiterplade assayplade allerede indeholder de positive kontrolceller opløselige lysater.
- Med en 12-kanals multipipettor, tilsættes 100 pi af GAS-stamme D471 til hver brønd. Umiddelbart placere pladen i mikroplade spektrofotometer.
- Overvåge de enzymkinetik ved måling af OD600 hvert 15 sek i 20 minutter.
- En PlyC variant med fremskridt termiske opførsel er defineret som en konstruktion, der kan formindske den oprindelige optiske densitet med 50 procent i mindst 900 sek vedikke-tilladende temperatur. Desuden er de positive kontroller (dvs. ikke-opvarmet, WT PlyC) skal vise WT katalytisk aktivitet (t 1/2 ≤ 100 sek) og de negative kontroller (dvs. opvarmet, WT PlyC) bør være uden aktivitet.
- Når en PlyC variant med skred termiske opførsel er identificeret, hente den oprindelige plade opbevaret ved 4 ° C og podes bakterier fra individuel brønd specifikt til mutant af interesse i friske LB-medier suppleret med ampicillin og chloramphenicol. Grow inoculum natten over ved 37 ° C.
- Udvinde og oprense plasmid DNA fra kulturen og derefter indsende til sekventering med henblik på at identificere de nukleotidmutationer der udleder øget termisk opførsel til PlyCA. Derudover supplere en lille prøve fra overnatskultur med 10% glycerol og opbevares ved -80 ° C til yderligere anvendelse.
Representative Results
Ved afslutningen af den første runde af tilfældig mutagenese blev over 6.000 PlyC mutanter screenet, og i alt 35 mutanter med potentielt øgede termiske opførsel blev identificeret, udvalgt og sekventeret. Genomisk analyse, opsummeret i tabel I, viser, at af de 35 kandidater, 7 af konstruktionerne indeholdt WT PlyCA sekvenser på niveauet for translation svarende til falske positiver identificeret af assayet. De resterende 28 kandidater blev mutationen intervallet 1-6 nukleotidmutationer med en gennemsnitlig mutation på 2,75 nukleotider pr plyCA-genet, som var i 2-3 nukleotid mutation interval vi målretning. På det translationelle niveau, gav dette nukleotid mutation og frekvensrespons en aminosyremutation området fra 1 til 5 aminosyrer, med en gennemsnitlig mutationsrate på 1,9 aminosyremutationer pr PlyCA polypeptid.
Af de 28 kandidater med mindst en aminosyre Mutation, blev fire af disse mutante konstruktioner tilfældigt valgt til yderligere karakterisering at validere, at den omfattende screening af instrueret evolution metoden rent faktisk fungerede korrekt. De mutante PlyC enzymer blev oprenset til> 95% homogenitet baseret på SDS-PAGE-analyse som tidligere beskrevet 6-7. Enzymkinetik af WT PlyC og hver af de fire PlyC mutanter blev karakteriseret ved ækvimolære koncentrationer efter inkubering af de oprensede enzymer ved forskellige forhøjede temperaturer. Aktivitet blev målt efter tilsætning af D471 GAS ved at måle den optiske densitet ved 600 nm hvert 15. sek i 20 minutter. Aktivitet blev defineret som den resterende maksimale hastighed for enzymet efter varme inkubation. Af de fire kandidater vilkårligt udvalgt til yderligere karakterisering viste mutant 29C3 den mest forbedrede termiske opførsel. Den termiske opførsel af WT PlyC og 29C3 blev undersøgt ved forskellige temperaturer under inkubering og analyse for aktivitet i PBS pH 7,2 ved80 nM og 40 nM koncentrationer hhv. De 45 til 50 ° C inkubation eksperimenter (fig. 3) blev udført i en thermocycler, hvor prøverne blev inkuberet i en tyndvægget 96 brønde thermocycler plade i et samlet volumen på 120 ul. Den 35 ° C, 40 ° C og 45 ° C inkubation eksperimenter (figur 4 og 5) blev udført i en varmeblok, hvor prøverne blev inkuberet i et 1,5 ml mikrocentrifugerør i et samlet volumen på 1,3 ml. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.
WT PlyC og 29C3 udviste ingen signifikant forskel i kinetisk stabilitet ved stuetemperatur (25 ° C) som afbildet i det første sæt søjler i figur 3. Efter en kortvarig inkubering i 30 minutter fra temperaturer fra 45-50 ° C, var aktiviteten af 29C3 er væsentligt større end aktiviteten er specifik for WT konstruktion ved hver temperatur punkt. For eksempel viste WT PlyC en 44% tab i aktivitet på 45,2° C henviser 29C3 udviste kun en 2% tab i aktivitet ved den samme temperatur.
Langvarige inkubation undersøgelser, der sammenligner den tilbageværende aktivitet af både WT PlyC og 29C3 blev yderligere udført ved 35 ° C og 40 ° C, der involverer måling af tilbageværende aktivitet efter 24 og 48 hr tidspunkter. Ved 35 ° C, 29C3 viste 41% og 176% højere aktivitet end WT PlyC efter 24 og 48 timers inkubering tidspunkter, henholdsvis (figur 4a). Ved 40 ° C, 29C3 viste 28% og 107% højere aktivitet end WT PlyC efter 24 og 48 timers inkubering tidspunkter, henholdsvis (figur 4b).
Den tilbageværende aktivitet af WT PlyC og 29C3 blev også overvåget hvert 20. minut i i alt 3 timer ved 45 ° C. WT PlyC var kun i stand til at tilbageholde 21% aktivitet efter en 3 timers inkubation ved denne temperatur mens 29C3 var i stand til at tilbageholde 46% aktivitet. Halveringstiden (t 1/2) for WT PlyC og 29C3 var 67 og 147 min, henholdsvis tyder ING at 29C3 har en 2,2 gange stigning i kinetisk stabilitet ved 45 ° C (figur 5).
| Samlet Round 1 Kandidater | 35 |
| Ansøgere med WT PlyCA Sequence | 7 |
| Ansøgere med ≥ 1 aminosyremutation | 28 |
| - Gennemsnitlig Nucleotide Mutation Rate (nt / plyCA) | 2,75 |
| - Nukleotid Mutation Range (nt) | 1-6 |
| - Gennemsnitlig aminosyremutation Rate (AA / PlyCA) | 1,9 |
| - Aminosyremutation Range (AA) | 1-5 |
Tabel 1. Candidate Pool Genomisk Analysis.
pload/4216/4216fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Instrueret evolution assay metodologi. På rettet evolution, begynder et med den ledende enzym, hvilket ville være WT PlyC til den første runde. Et bibliotek af PlyC mutanter indeholdende tilfældige uvildige nukleotidmutationer til plyCA genet konstrueres derefter ved en fejltilbøjelig DNA-polymerase, klonet ind i ekspressionsvektoren pBAD24 og transformeret ind i E. coli-stamme DH5a allerede indeholder pBAD33:. plyCB Individuelle transformanter podes i deres egne specifikke brønd i en mikrotiterplade med 96 brønde. Gennem en omfattende screening proces er individuelle PlyC mutanter, der er katalytisk aktivt efter inkubation ved en ikke-tilladte temperatur betegnes som mutanter med forøget kinetisk stabilitet. Theconstruct vise den mest skred termiske opførsel vil følgelig bliver den indledende enzym til den næste runde af tilfældig mutagenese. Overordnet er der tre komplette runder af random mutagenese efterfulgt af DNA-shuffling resulterede i en bakteriolytisk molekyle med udviklede termiske opførsel. Klik her for at se større figur .
Figur 2. 96-brønds mikrotiterplade skabeloner til dirigeret evolution assay. Mikrotiterpladen skematiske under bestemmelsen af de optimale opvarmningsbetingelser (figur 2a) består af inokulering af en enkelt parental WT PlyC klon i hver række i mikrotiterpladen. Mikrotiterpladen skematiske under mutant screening (figur 2b) består af inokulering hver brønd i kolonne 1 med en unik parentale WT PlyC klon samt inokulering hver brønd i kolonne 2-12 med et særskilt PlyC mutantklon. Wells A1-D1 er udpeget for de positive forældrekontrol, som samarbejdedensist af WT PlyC konstruktioner ikke udsættes for ikke-tilladte temperatur inkubation. Wells E1-H1 er udpeget for de negative forældrestyring, der består af WT PlyC konstruktioner, der udsættes for ikke-tilladte temperatur inkubation.
Figur 3. Restaktivitet kinetiske analyse, der sammenligner WT PlyC og 29C3. Enzymer blev oprenset til homogenitet og inkuberet i 30 minutter i en thermocycler i lige store molære koncentrationer ved enten stuetemperatur eller ved en temperaturgradient i området fra 45-50 ° C. Enzymatisk aktivitet korrelerer med den maksimale hastighed vises efter specifik temperatur inkubering. Med undtagelse af 25 ° C og 47,7 ° C, er variationen i aktivitet mellem WT og 29C3 ved hver temperatur korreleret med en p-værdi <0,05. Alle data er anført som middelværdien ± SEM af tre uafhængige eksperimenter. 
Figur 4. Restaktivitet kinetiske analyse, der sammenligner WT PlyC til 29C3 ved 35 ° C og 40 ° C. Lige molære koncentrationer af oprenset WT PlyC og 29C3 blev inkuberet i en varmeblok ved 35 ° C (figur 4a) eller 40 ° C (figur 4b). Den tilbageværende enzymaktivitet blev målt ved 24 og 48 hr tidspunkter. Aktiviteten udvist af hver konstruktion blev normaliseret til den maksimale hastighed vises på tidspunkt nul. Variationen i aktivitet mellem WT og 29C3 ved hver temperatur og tidspunkt korreleres til en p-værdi <0,05. Alle data er anført som middelværdien ± SEM af tre uafhængige eksperimenter.
Figur 5. Restaktivitet kinetiske analyse, hvorWT PlyC til 29C3 ved 45 ° C. Lige molære koncentrationer af oprenset WT PlyC og 29C3 blev inkuberet i en varmeblok ved 45 ° C, og den tilbageværende enzymaktivitet blev målt hvert 20. minut i 3 timer. Aktiviteten udvist af hver konstruktion blev normaliseret til den maksimale hastighed vises på tidspunkt nul. Med undtagelse af datapunkterne ved 20 min, korreleret variationen i aktivitet mellem WT og 29C3 på hvert tidspunkt med en p-værdi <0,05. Alle data er anført som middelværdien ± SEM af tre uafhængige eksperimenter.
Discussion
Denne protokol, som er skitseret i figur 1, viser en mikrotiterplade med 96 brønde metode, der gør det muligt at udnytte rettet evolution at forøge termostabiliteten af et bakteriolytisk enzym. Ved anvendelse af en fejltilbøjelig DNA-polymerase, kan man indføre tilfældige mutationer, der øger den samlede kinetiske stabilitet af det translaterede bakteriolytisk molekyle af interesse, der typisk er på grund af molekylære reorganisering bestående af stigende elektrostatisk, disulfidbro og hydrofobe interaktioner, der frembringer forbedret molekylær pakning, forbedrede modifikationer af overfladeladning netværk eller styrkelse af en højere oligomerisering tilstand 17-18. Efter indførelsen af nucleotid-mutationer, blev en omfattende screeningsprocedure derefter anvendes til at identificere mutationer, der er termisk fordelagtig. De repræsentative resultater, der præsenteres her, er baseret på en runde af tilfældig mutagenese. I virkeligheden er det blevet foreslået, atmindst tre successive runder af vilkårlig mutagenese, hver anvendelse af den mest robuste mutant som ledende enzym, efterfulgt af DNA-shuffling er egnet til disse typer rettet evolution termiske adfærdsstudier 2.
Det er vigtigt at forstå, at mens denne protokol identificerer mutationer, der forøger kinetisk stabilitet, har disse varianter ikke nødvendigvis har øget termostabilitet. Et molekyle anses for termostabil, når det har evnen til at bevare sin struktur ved en høj temperatur. Men i den viste assay restaktiviteten af de mutante lysater ikke analyseret ved den samme temperatur, som de oprindeligt blev inkuberet ved under varmebehandlingen trin og dermed en kan selektion for mutationer, der fremmer refoldning frem for forbedret termostabilitet 19. Mens vi ekstrapolere termiske opførsel som en indikation af termisk stabilitet, skal sand termisk stabilitet måles empirisk ved Biophysgiske metoder, såsom cirkulær dikroisme (CD), differentiel scanningskalorimetri (DSC) og differentiel scanningskalorimetri fluorimetri (DSF). Foreløbige data fra CD og DSF eksperimenter antyder, at flere kandidater identificeret fra den fremlagte metode rent faktisk vise skred termostabilitet (data ikke vist).
Selv om de metoder, der her er specifikt for gennemførelse øget termisk adfærd til PlyC, kan denne samme metode desuden anvendes for at forøge termisk aktivitet til andre bakteriolytiske enzymer med nogle mindre ændringer af variabler såsom buffere, mutationsrater, opvarmningsbetingelser og ekspressionssystemer. En kritisk variabel i forbindelse med dette assay angår nucleotid mutationsrate af fejl-tilbøjelige DNA-polymerase. Vi valgte at bruge fejlbehæftede Mutazyme II DNA-polymerase i vores dirigeret evolution assay skyldes eksperimentel tyder dette bestemt enzym viser den mindste mængde af bias medhensyn til hvilke nukleotider er tilfældigt inkorporeres i genet af interesse i forhold til andre tilfældig mutagenese teknikker, såsom anvendelse af hydroxylamin, mutator E. coli-stammer og andre fejlbehæftet DNA polyermases 20. Generelt ser lavere mutationsrater at være mere ønskeligt af to grunde. Dels engineering termostabilitet til proteiner typisk består af relativt få aminosyresubstitutioner. Høje mutationsrater kan forårsage dramatiske strukturelle ændringer til bestemte molekyler, der kan endeligt resultere i strukturel misfoldning og funktionelle uoverensstemmelser. For eksempel kan inkorporeringen af glycin og prolinrester forstyrrer alfa spiralformede sekundære strukturer 21. Dels høje nucleotid mutationsrater øge chancerne for inkorporering præmature stopcodoner, hvilket resulterer i afkortede molekyler, som er biologisk inaktiv. I almindelighed er lavere mutationsrater foretrækkes, fordi lavere error rates resulterer i accumultion af adaptive mutationer mens højere mutationsrater genererer neutrale eller skadelige mutationer 22.
For hver runde af vilkårlig mutagenese, involverer et andet kritisk variabel, at man skal optimere inkubationstemperaturen anvendes under screeningsprocessen. Udvælgelse af den eksperimentelle ikke-tilladende temperatur er forholdsvis krævende. Vi oprindeligt brugt en inkubationstemperaturen der var 10 ° C højere end den ikke-tilladende temperatur PlyC, men efter screening 3.000 mutanter, var vi ikke i stand til at identificere eventuelle fordelagtige mutationer. Med tanke rettet evolution metoder består af sekventielt identificerer gavnlige aminosyresubstitutioner, der har additiv effekt blev det fastslået, at en mindre streng temperatur bør anvendes under screeningen proces, selv om det øgede chancen for at generere falske-positive. Som sådan, anvendte vi en inkubationstemperatur, der kun var et par grader over den ikke-Tilladtive temperatur og screenet igen udvalgte ansøgere til at udelukke de falske positiver.
Vi besluttede at anvende en inkubationstemperatur der ikke var for tempereret (≤ 1 ° C højere end den laveste ikke-tilladende temperatur) og omvendt ikke alt for hårde (≥ 5 ° C højere end den laveste ikke-tilladende temperatur). Den ideelle temperatur besluttede vi at bruge i dette særlige assay var en moderat 2 ° C højere end den eksperimentelt bestemte ikke-tilladende temperatur. At vælge en temperatur, der er for mild vil resultere i en langt højere falsk positiv identifikation end den ~ 20% vi observeret (tabel I) ved brug af en moderat inkubationstemperatur. Desuden kan anvendelse af en inkubationstemperatur, der er for hårde sidste ende føre til manglende evne til at identificere mutanter med signifikant forbedret termisk opførsel. For eksempel ° anvendelse af en inkubationstemperatur på ≥ 5 C ville have resulteret i manglende evne til at identificerelovende 29C3 mutant samt hovedparten af de øvrige kandidater valgt i første runde af screening.
I summation giver vi en protokol for ingeniør bakteriolytiske enzymer at erhverve forøget kinetisk stabilitet. Endvidere kan det samme assay, uden de opvarmningstrin, der anvendes til screening for mutationer, der forøger katalytisk aktivitet. Forstærke både katalytisk aktivitet og termostabilitet er en vigtig udviklingsmæssig hurdle overfor enhver terapeutisk enzym. Mens detaljerne i denne protokol er specifikke for endolysin PlyC, kan metoden tilpasses enhver bakteriolytisk enzym med kun et par ændringer. Vi præsenterede foreløbige resultater fra kun den første runde af mutagenese som validerer, at funktionaliteten af assayet, hvilket resulterer i gennemførelse og identifikation af mutationer, der genererer en stigning i molekylær termostabiliteten af betydelig størrelse.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Emilija Renke og Janet Yu for teknisk assistance. DCN er støttet af tilskud fra USA Department of Defense (DR080205, DM102823, OR09055, og OR090059). RDH understøttes af en bevilling fra Maryland Landbrug Experiment Station og en NIH Training Grant i Cell and Molecular Biology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 | |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 | |
| Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 | |
| 96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 | |
| Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 | |
| Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 | |
| pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 | |
| pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |
References
- Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D.
- Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting. Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).
- Fischetti, V. A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).
- Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum. Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).
- Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins--current state of research and applications. Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).
- Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. PlyC: A multimeric bacteriophage lysin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).
- Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).
- Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization. Biochimie. 92, 507-513 (2010).
- Varea, J., et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).
- Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding. J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).
- Anderson, G., Scott, M. Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse. Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).
- Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability. Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).
- Koutsioulis, D., et al. Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase. Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).
- McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).
- Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli. Microbial cell factories. 8, 66 (2009).
- Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution. J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).
- Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B.
- Kumar, S., Nussinov, R. How do thermophilic proteins deal with heat. Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).
- Hibbert, E. G., Dalby, P. A. Directed evolution strategies for improved enzymatic performance. Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).
- Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment. Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).
- Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution. J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).
- Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. How enzymes adapt: lessons from directed evolution. Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).
