Summary
thermostability 공학 분야에 해당 소설 감독 진화 방법은 bacteriolytic 효소 용으로 개발하고 결과적으로 확인되었습니다. 고온의 부화 후 야생 형 단백질에 비해 무작위 mutagenesis의 한 라운드, 발전 bacteriolytic 효소, PlyC 29C3는 두 번 잔류 활동보다 더 큰 표시 한 후.
Abstract
감독 진화는 자연의 단백질과 연결되어 있지 않은 특정 속성을 얻기 위해 단백질을 처리하기 위해 자연 선택을 활용하는 방법으로 정의됩니다. 문학 성공적으로 분자 특이성과 촉매 하나를 변경하도록 지시 진화의 구현에 대한 많은 증거를 제공하고 있습니다. 대신 분자 공학에 대한 더 많은 합리적 기반 접근법의 지시 진화를 활용의 주요 이점은 2 상영 할 수 있습니다 변종의 볼륨과 다양성에 관한 것이다. 감독 진화 한 가지 가능한 응용 프로그램 등 endolysins 등 bacteriolytic 효소의 향상 구조 안정성을 포함한다. 인코딩 및 자손의 virions의 숙주 세포의 용해와 해방의 결과, 박테리아의 peptidoglycan (예 : 세포 벽)에 중요한 공유 결합을 hydrolyze하는 endolysins을 표현을 박테리오파지. 특히,이 효소는 extrinsically suscept에 용해를 유도 할 수있는 능력을 가지고파지의 부재와 나아가 였죠 박테리아는 체외에서와 치료 가능성 3-5에 대한 생체의 모두 확인되었습니다. 우리의 지시 진화 연구의 주제는 PlyCA 및 PlyCB subunits 6로 구성되어 있습니다 PlyC endolysin을 포함합니다. 정화되고 extrinsically 추가하면 PlyC holoenzyme 초 만에 그룹 streptococci (GAS)뿐만 아니라 다른 구균 그룹을 lyses 게다가 GAS 7에 대한 생체에서 확인되었습니다. 크게 상승 온도 부화 후 잔여 효소 반응 속도론을 모니터링하는 것은 PlyC이 효소의 추가 개발을 제한 할 수 있습니다 짧은 치료 수명을 제안, 45 ° C에서 갑자기 lytic 활동을 잃게 고유 한 증거를 제공합니다. 또한 연구 PlyCB의 subunit이 안정 반면, 열 안정성의 부족 만 PlyCA의 subunit에 대한 관찰 공개까지 ~ 90 ° C (게시되지 않은 관찰). PlyC뿐만 아니라, S가 있습니다endolysins의 thermolabile 특성을 설명하는 문학에 everal 예. 예를 들어, 황색 포도상 구균 endolysin LysK과 연쇄상 구균 pneumoniae endolysins 상병-1 및 PAL은 42에 자발적으로 활동을 잃게 ° C, 43.5 ° C와 50.2 ° C, 각각 8-10. 특정 시스템에서의 온도 현재까지 화학 반응의 속도를 관련 Arrhenius 방정식에 따르면, thermostability의 증가는 유통 수명 11 증가 상관 관계를합니다. 이 끝으로, 감독 진화는 자연 속에서 다양한 분자의 열 활동을 변경을위한 유용한 도구로 표시되었습니다,하지만이 기술은 bacteriolytic 효소의 연구에 성공적으로 악용되지 않았습니다 않습니다. 마찬가지로, antimicrobials의 특정 클래스의 구조 안정성을 진행 성공적으로 계정이 모두 존재합니다. 이 동영상에서는, 우리는 오류 PR를 사용하는 새로운 방법을 채택한 DNA 중합 효소는 효소의 운동 안정성의 증가 (그림 1) 상관 관계를 PlyC 구균의 endolysin의 PlyCA의 subunit에 돌연변이를 식별 할 수 96 잘 microtiter 플레이트 형식을 사용하여 최적의 심사에 이어. 임의 mutagenesis 중 하나 라운드 후 결과는 방법은 고온 처리 한 후 야생 유형 (WT) PlyC에 비해 두배 이상 잔류 활동을 유지 PlyC 변종을 생성하는 것이 좋습니다.
Protocol
1. 최적의 난방 조건을 결정하는
첫째, 하나는 실험적으로 최적 배양 온도와 분석의 가열 단계에 사용할 시간을 결정해야합니다. 우리 PlyC 모델 들어, 유의하는 것이 중요합니다 그 E. 대장균 별도의 표현 plasmids에 plyCA 및 plyCB 유전자와 공동 변화는 모든 기능 PlyC holoenzyme 6 형성 보여왔다. 뿐만 아니라 세포 성장 조건과 이후의 복제 도금 기술 등 96 잘 microtiter 플레이트 준비는 문학 12-16에서 제공하는 예제에서 적응되었습니다. 이전 열 불 활성화 실험의 결과는 생리적 온도 (게시되지 않은 관찰)을 초과하는 환경에서의 단기 부화 기간 동안 활동의 급격한 손실을 지시로 30 분의 부화 시간이 분석에 적합합니다. PlyC에 대한 최적의 배양 온도는 다음 단계에 elucidated되었습니다
- 트란관할 E.에 plyCA (앰프 R) : 표현 구조 pBAD24을 sform plyCB (CM R) : 대장균은 DH5α pBAD33 변형.
- 암피실린 (100 μg / ML)과 chloramphenicol (35 μg / ML)로 보충 Luria-Bertani (LB) 한천 플레이트에 플레이트 transformants합니다. 37 박 접시를 품다 ° C.
- 멸균 이쑤시개로 잘 평면 바닥, 명확하고 멸균 96에서 우물의 각 행 (그림 2A)로 개별 식민지의 예방, 암피실린 및 chloramphenicol과 보충 LB 200 μl를 포함 microtiter 플레이트는 lidded.
- 안전하게 37 96 잘 microtiter 플레이트를 배치 ° C 배양기를 흔들어 300 rpm으로 하루 아침에 박테리아를 성장.
- 37에서 96 잘 microtiter 플레이트를 검색 ° C 다음과 같이 새로운 96 잘 microtiter 접시에 보육과 복제 판을 흔들 :
- 암피실린 및 chloramphenicol과 보충 LB 180 μl를 추가합니다복제 플레이트의 각 잘합니다.
- 복제 판의 해당 우물에 원래 접시에서 세균의 20 μl를 전송합니다. 이 ~의 초기 OD 600 0.5 될 것입니다.
- 안전하게 37 복제 판을 배치 ° C 배양기를 흔들어 300 rpm으로 1 시간에 판을 길러 다음 inductant를 추가합니다. pBAD 표현 시스템의 경우, inductant는 0.25 % arabinose입니다. 다른 표현 시스템은 다른 inductants이 필요할 수 있습니다. 37 다시 판을 놓고 ° C 단백질 표현을 할 수 있도록 추가 4 시간 300 rpm으로 보육과 쉐이크를 흔들어. 표현 수준은 일반적으로 PlyC의 10-20 μg 사이에 다양합니다.
- 단백질식이 체결되면, 96 잘 microtiter 플레이트에 맞는 스윙 - 양동이 회 전자를 포함하는 냉장 원심 분리기에서 96 잘 microtiter 플레이트를 삽입하여 복제 플레이트와 펠렛 박테리아를 검색합니다. 실온에서 10 분 동안 3,000 rpm으로 원심 분리기.
- 천천히 반전 microtiter 플레이트에서 미디어 표면에 뜨는을 제거하고 부드럽게 미디어를 decanting.
- 각 잘에 B-PER II 박테리아 단백질 추출 시약의 50 μl를 추가하여 셀을 Lyse. 20 분 동안 실온에서 판을 품다.
- 인산염의 70 μl를 추가하여 120 μl 각도에있는 볼륨을 증가 생리 (PBS) pH를 7.2 버퍼.
- 펠렛 4에 10 분 ° 냉장 원심 분리기에서 C 3,000 rpm으로 판을 회전하여 불용성 세포 파편.
- 96 잘 thermocycler 판의 해당 우물에 용해 원유의 lysate 110 μl를 전송합니다.
- 미리 배양 시간을 30 분을 사용하여 현재 15-20 ° C.에 걸쳐 폭 넓은 그라디언트 온도 범위에 96 잘 thermocycler 판에 거주하는 수용성 lysates 노출 참고 목적은 특정 효소가> 95 % 촉매 활동을 잃으면 무엇 온도를 결정하는 것입니다.
- 부화 후, 잘 96 품다4에 thermocycler 판 5 분 잘 최종 96 microtiter 접시에 해당 아니라 위치에 96도 thermocycler 판에서 용해 lysates 100 μl를 전송을위한 ° C.
- 12 채널 multipipettor으로 각도에 가스 변형 D471 100 μl를 추가합니다. 참고 D471 세포는 원래 밤 문화에서 동결 건조와 ~ 2.0의 OD 600를 얻기 위해 PBS 산도 7.2에 resuspended 있습니다.
- 즉시 20 분의 OD 600마다 15 초를 측정하여 microplate 분광 광도계에 96 잘 플레이트를 배치하고 효소 반응 속도론을 모니터링 할 수 있습니다. 광학 밀도의 변화 (ΔOD ≤ 0.1)이 부족해 우물에 대응 최저 온도 부화는 비 허용 온도로 정의됩니다.
넓은 온도 화면이 비 허용 온도를 식별하기 위해 수행 한 후 위의 단계 온도보다 좁은 범위 (5 ° -10는 ° C) 명료하게하다로 반복 할 수 있습니다관심 효소에 대한 정확한 비 허용 온도. 참고이 분석에서 확인 된 비 허용 온도 인해 볼륨의 차이, 집중력 등을 다른 방법으로 elucidated 녹는 온도와 다를 수 있습니다
2. 돌연변이 라이브러리를 생성
상영되는 돌연변이 라이브러리의 생성은 임의로 다음과 같이 GeneMorph II 무작위 Mutagenesis 키트를 사용하여 plyCA 유전자의 염기 최소한의 편견과 오류가 발생하기 쉬운 DNA의 중합 효소에 의해 변이를 포함하는 것을 포함 :
- 5 '및 3'plyCA 유전자의 끝에서 선택의 제한 사이트로 55-72 ° C 사이의 유사한 녹는 온도 (T m)과 염기 프리 머을 디자인합니다.
- 원하는 돌연변이 속도가 plyCA 당 2 ~ 3 개의 세포핵 (1.4 KB)이기 때문에, 낮은 돌연변이의 F에 대한 PCR 반응 구성 요소 농도뿐만 아니라 제조업체에서 권장하는 thermocycler 조건을 사용하여requencies (KB 당 0-4.5).
- 발현 벡터 pBAD24에 mutagenized plyCA의 유전자를 복제.
- plyCB 배경 및 암피실린과 chloramphenicol과 보충 LB 한천 플레이트에 플레이트 transformants : DH5α pBAD33로 구조를 변환 할 수 있습니다.
- 또한, 변환 및 플레이트 DH5α pBAD33를 : plyCB 발현 벡터 pBAD24는 WT plyCA 유전자를 포함하는과. 이 판의 식민지가 심사를하는 동안 컨트롤이 될 것입니다.
3. 96 자 Microtiter 판금 준비 및 세포의 성장 조건
- 암피실린 및 chloramphenicol과 보충 LB 200 μl와 96 잘 microtiter 플레이트의 각 우물을 입력합니다.
- microtiter 플레이트 도식 (그림 2B) 후, 조심스럽게 소독 이쑤시개로 하루 아침에 한천 플레이트에서 개별 식민지를 선택하고 96도 지정 잘 microtiter 찮아에서 박테리아의 예방테. 그것은 당 하나의 식민지가 잘 주사되어 있는지 확인하는 것이 필수적입니다.
- 37 박 300 rpm으로 안전하게 고정 96 잘 microtiter 접시를 흔들어 ° C.
4. 복제 도금, 단백질 표현 유도 및 Lysate 준비
- 한 수정과 "최적의 가열 조건을 확인"섹션에서 단계 1.5-1.11를 따르십시오. 복제 도금 단계는 결론을 내 렸습니다 ° C 이후 4에 원래 판을 저장합니다.
- 후 단계 1.11, 긍정적 인 제어 우물 A1-D1을 제외하고 96도 thermocycler 판의 해당 우물에 용해 원유의 lysate의 이전 110 μl. 긍정적 인 제어 lysates (가열하지 않는 즉, lysates), 얼음의 실험과 상점에 대한 최종 분석 판 역할을하는 새로운 96 잘 microtiter 플레이트의 해당 우물에 lysates의 양도 100 μl에 관해서는 요.
5. 수용성 Lysate 열처리
- 부정적인 제어 및 1 단계에서 확인한 최적화 된 비 허용 배양 온도에서 30 분의 thermocycler에서 96도 thermocycler 판에서 현재 국한 lysates 돌연변이 가용성을 가열.
- 비 허용 온도 부화 후 5 분에 대해 4 ° C에서 96도 thermocycler 판을 품다.
- 이미 긍정적 인 제어 용해 lysates가 포함 된 최종 96 잘 microtiter 분석 판에서의 동일한 아니라 위치에 96도 thermocycler 판에서 용해 lysates 100 μl를 전송합니다.
- 12 채널 multipipettor으로 각도에 가스 변형 D471 100 μl를 추가합니다. 즉시 microplate 분광 광도계의 판을 놓습니다.
- 20 분의 OD 600 매 15 초를 측정하여 효소 반응 속도론을 모니터링 할 수 있습니다.
- 진행 열 동작과 PlyC 변종에 이하 900 초에 50 % 원래 광학 밀도를 줄일 수 구조로 정의됩니다비 허용 온도. 또한, 긍정적 인 컨트롤 (예 : 비 온수 WT PlyC) WT 촉매 활동을 표시해야합니다 (t 2분의 1 ≤ 100 초)과 부정적인 컨트롤 (즉, WT PlyC를 가열) 활동이없는 있어야합니다.
- 와 PlyC 변종이 열 동작이 확인되어 진행되면, 암피실린 및 chloramphenicol과 보충 신선한 LB 미디어에 관심 돌연변이에 잘 특정 개인에서 4 ° C와 예방 세균에 저장되어있는 원래의 판을 검색합니다. 37 박 inoculum를 성장 ° C.
- 추출하고 정화 플라스미드 DNA를 문화에서 다음 PlyCA에 향상된 열 동작을 유추 염기 변이를 확인하기 위해 배열 제출합니다. 또한 -80에서 10 % 글리세롤 및 매장 ° C 더 사용하기 위해 함께 밤 문화에서 작은 나누어지는을 보완.
Representative Results
임의 mutagenesis의 첫 번째 라운드의 결론에서 6000여 PlyC 돌연변이가 상영되었으며, 잠재적으로 증가 열 동작 35 돌연변이의 총, 확인을 선택하고 순서가되었다. 표 I을에 요약 게놈 분석, 제안 35 후보 분석에 의해 식별 탐지에 해당하는 번역의 수준 WT PlyCA 시퀀스를 포함 구조 7의. 나머지 28 후보, 돌연변이 범위는 1에서 우리가 타겟 2-3 염기 변이의 범위에있을 plyCA 유전자 당 2.75 세포핵의 평균 돌연변이 비율 6 염기 변이로했다. 병진 수준에서 특정 염기 변이 범위와 주파수는 폴리펩티드 PlyCA 당 1.9 아미노산 변이의 평균 변이 속도로 1 ~ 5 아미노산의 아미노산 변이 범위를 나왔고.
적어도 하나의 아미노산 mutat있는 28 후보자의이온이 돌연변이 구조 네 가지가 무작위로 이동 진화 방법론의 광범위한 심사는 실제로 제대로 작동되었는지 확인하기 위해 추가 특성에 선정되었습니다. 돌연변이 PlyC 효소는 이전 6-7에 설명 된대로 SDS-PAGE 분석에 기초> 95 %의 동질성을 정화했다. WT PlyC와 네 PlyC 돌연변이 각각의 효소 반응 속도론은 다양한 높은 온도에서 정제 된 효소를 잠복기 후 동일한 몰 농도에 특성화되었다. 활동은 20 분에 600 nm의 매 15 초에서 광학 밀도를 측정하여 D471 GAS를 추가 한 후 모니터링했다. 활동 열 부화 후 효소의 잔류 최대 속도로 정의되었다. 무작위로 추가 특성에서 선택한 네 개의 후보, 돌연변이 29C3는 가장 향상된 열 동작을 보여 주었다. 잠복기와의 PBS 산도 7.2의 활동 시금 동안 WT PlyC와 29C3의 열 동작이 다른 온도에서 조사 된80 나노 미터 및 40 나노 미터 농도, 각각. 45-50 ° C의 배양 실험 (그림 3)은 샘플을 120 μl의 총 볼륨의 얇은 벽 96도 thermocycler 판에 incubated되었습니다 thermocycler에서 수행되었다. 35 ° C, 40 ° C와 45 ° C 배양 실험 (그림 4 및 5) 샘플을 1.3 ML의 총 볼륨에서 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 incubated되었습니다 열 블록에서 수행되었다. 모든 실험은 triplicates에서 수행되었다.
WT PlyC와 29C3는 실내 온도 (25 ° C) 그림 3 바의 첫 번째 세트에서 아닙니다.의 운동 안정성에 큰 차이를 보여주지 그러나, 45-50 이르기까지의 온도에서 30 분 ° C의 단기 부화 후 29C3의 활동은 각 온도 지점에 건설 WT의 특정 활동을보다 실질적으로 더했습니다. 예를 들어, WT PlyC는 45.2에서 활동에 44 %의 손실을 표시° C 반면 29C3 같은 온도에서 활동에만 2 %의 손실을 보여 주었다.
WT PlyC와 29C3 모두의 잔여 활동을 비교 장기 배양 연구가 추가로 35 수행되었습니다 ° C와 40 ° C 24 및 48 시간 시간 지점에서 잔류 활동의 측정을 포함. 35 ° C, 29C3은 41 %를 표시, 24시 WT PlyC 및 48 시간의 배양 시간 포인트 각각 (그림 4A)보다 176퍼센트 높은 활동. 40 ° C, 29C3은 28 %를 표시, 24시 WT PlyC 및 48 시간의 배양 시간 포인트 각각 (그림 4B)보다 1백7퍼센트 높은 활동.
WT PlyC와 29C3의 잔여 활동도 45 3 시간의 총 매 20 분 ° C.를 모니터링 한 WT PlyC는 29C3 46 %의 활동을 유지 할 수있었습니다 반면,이 온도에서 3 시간의 부화 후 21 % 활동을 유지 할 수있었습니다. WT PlyC 및 29C3에 대한 반감기는 (t 1 / 2) 각각 67 147 분있었습니다 제안 ING 그 29C3은 45 ° C (그림 5)에서 운동 안정성에 2.2 배 증가합니다.
| 총 1 라운드 후보 | 35 |
| WT PlyCA 순서로 후보 | 7 |
| ≥ 한 아미노산 돌연변이가있는 후보자 | 28 |
| - 평균 염기 돌연변이 속도 (NT / plyCA) | 2.75 |
| - 염기 돌연변이 범위 (NT) | 1-6 |
| - 평균 아미노산 돌연변이 속도 (AA / PlyCA) | 1.9 |
| - 아미노산 돌연변이 범위 (AA) | 1-5 |
표 1. 후보 풀 게놈 분석.
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1 그림. 감독 진화 분석 방법론이 있습니다. 감독 진화에, 하나는 첫 라운드에 대한 WT의 PlyC 될 리드 효소와 함께 시작합니다. plyCA 유전자에 무작위로 편향 염기 변이를 포함하는 PlyC 돌연변이의 라이브러리는 다음 오류가 발생하기 쉬운 DNA의 중합 효소에 의해 만들어진 발현 벡터 pBAD24으로 복제 및 E.으로 변화됩니다 대장균은 이미 pBAD33를 포함하는 DH5α 변형 :. plyCB 개인 transformants은 96 잘 microtiter 플레이트 잘 자신의 특정에 주사합니다. 광범위한 심사 과정을 통해 비 허용 온도에서 배양 한 후 catalytically 활성 개별 PlyC 돌연변이가 강화 운동 안정성과 뮤턴트으로 분류됩니다. 결과적으로 무작위 mutagenesis의 다음 라운드를위한 리드 효소된다 것이다 가장 진행 열 동작을 나타내는 Theconstruct. 전반적으로, rando 세 전체 라운드가 없습니다m mutagenesis 진화 열 동작과 bacteriolytic 분자의 결과 DNA 셔플 링이 나타납니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 감독 진화 분석을위한 96 잘 microtiter 플레이트 템플릿. 최적의 가열 조건의 결정시 microtiter 플레이트 도식 (그림 2A)은 microtiter 플레이트의 각 행에 하나의 부모 WT PlyC의 클론을 inoculating로 구성되어 있습니다. 돌연변이 검사 (그림 2B) 동안 microtiter 플레이트 도식은 고유 한 부모 WT PlyC 클론과 함께 열 1에 각 우물을 inoculating뿐만 아니라 독특한 PlyC 돌연변이 클론이있는 열이 2-12 각 우물을 inoculating로 구성되어 있습니다. 웰스 A1-D1은 공동 긍정적 인 부모의 컨트롤에 지정되어 있습니다WT PlyC의 nsist가 아닌 허용 온도 부화에 노출되지 생성합니다. 웰스 E1-H1은 비 허용 온도 부화에 노출되어 있습니다 WT PlyC 구조로 구성 부정적인 부모의 컨트롤에 지정되어 있습니다.
그림 3. WT PlyC와 29C3을 비교 잔류 활동을 운동 분석. 효소는 동질성을 정화하고 실내 온도 중 하나이나 45-50에서 ° C. 사이 인 온도 기울기에서 동일한 몰 농도에 thermocycler에서 30 분 동안 incubated되었습니다 효소 활동은 특정 온도 부화 후 표시되는 최대 속도로 연결합니다. 25 ° C와 47.7를 제외한 ° C, P-값 <0.05로 상관 각 온도에서 WT와 29C3 사이의 활동에 변화. 모든 데이터는 평균 ± 세 독립적 인 실험 SEM로보고됩니다. 
4 그림. 35 29C3에 WT PlyC을 비교 잔류 활동을 운동 분석 ° C와 40 ° 정화 WT PlyC와 29C3의 C. 균등 몰 농도가 35 ° C (도 4a) 또는 40 ° C (그림 4B)에서 열 블록에 incubated되었습니다. 잔여 효소 활동은 24 및 48 시간 시간 지점에서 측정되었다. 각 구조에 의해 표시되는 활동 시간 포인트 제로에 표시하는 최대 속도로 표준화되었다. 각 온도와 시간 시점에서 WT와 29C3 사이의 활동에 변화는 P-값 <0.05로 상관. 모든 데이터는 평균 ± 세 독립적 인 실험 SEM로보고됩니다.
그림 5. 비교 잔류 활동 운동 분석45 29C3에 WT PlyC ° 정화 WT PlyC와 29C3의 C. 균등 몰 농도는 45 ° C 및 잔여 효소 활동이 3 시간마다 20 분을 측정 한에서 열 블록에 incubated되었습니다. 각 구조에 의해 표시되는 활동 시간 포인트 제로에 표시하는 최대 속도로 표준화되었다. 20 분에서 데이터 포인트를 제외하고, 각 시점에서 WT와 29C3 사이의 활동에 변화는 P-값 <0.05로 상관. 모든 데이터는 평균 ± 세 독립적 인 실험 SEM로보고됩니다.
Discussion
그림 1에 설명이 프로토콜은, 하나는 모든 bacteriolytic 효소의 thermostability을 높이기 위해 감독 진화를 활용 할 수있는 96 잘 microtiter 플레이트 방법론을 제공합니다. 향상을 생성 오류가 발생하기 쉬운 DNA의 중합 효소의 사용을 통해, 하나는 일반적으로 정전기 증가 구성된 분자 reorganizations로 인해 관심의 번역 bacteriolytic 분자의 전체 운동 안정성을 향상 무작위로 변이를 도입 할 수 disulphide 다리와 소수성이 상호 작용 분자 포장, 표면 전하 네트워크 또는 높은 oligomerization 상태 17-18 강화의 강화 수정. 염기 변이의 도입 후, 광범위한 심사 절차는 다음 열 유익한 변이를 식별하는 데 사용되었다. 여기에 제시된 대표 결과는 무작위 mutagenesis 중 하나 원형을 기반으로했다. 현실에서, 것을 제안했습니다임의 mutagenesis의 적어도 세 연속 발은 DNA 셔플 링 뒤에 리드 효소로 가장 강력한 돌연변이를 사용하여 각 감독 진화 열 행동 연구의 이러한 유형 2에 대한 적합합니다.
그것은이 프로토콜 운동 안정성을 증대 변이를 식별하는 동안,이 변종은 반드시 thermostability을 증가하지 않는 것이 이해하는 것이 중요합니다. 는 높은 온도에서 구조를 유지 할 수있는 능력이있는 경우 분자는 내열 간주됩니다. 그러나, 제시된 분석에서 돌연변이 lysates의 잔류 활동들은 처음 열처리 단계에서의 incubated되었습니다 그래서 하나는 19 refolding보다 향상된 thermostability을 촉진 변이에 대한 선택 될 수있는 동일한 온도에서 assayed되지 않습니다. 우리는 열 안정성은 표시대로 열 동작을 외삽 법에 의해 추정하는 동안, 사실 열 안정성이 biophys에 의해 경험적으로 측정해야이러한 원형 이색 성 (CD), 차동 스캐닝 열량 측정법 (DSC) 및 차동 검사 fluorimetry (DSF)와 같은 ICAL 방법. CD 및 DSF 실험에서 예비 데이터를 제시 방법에서 식별 여러 후보자가 실제로 진행 thermostability을 (데이터가 게재되지 않음) 표시 않는 것이 좋습니다.
여기에 제시된 방법은 PlyC로 증가 열 동작을 구현에만 수 있지만,이 같은 방법론은 또한 같은 버퍼, 돌연변이 요금, 난방 조건 및 표현 시스템과 같은 변수에 약간의 변경과 다른 bacteriolytic 효소에 열 활동을 강화하기 위해 고용 할 수 있습니다. 이 분석과 관련된 하나의 중요한 변수는 오류가 발생하기 쉬운 DNA의 중합 효소의 염기 변이 속도에 관한 것이다. 우리는 인해 특정 효소가와 편견의 최소 금액을 표시 제안 실험적 증거에 우리의 이동 진화 분석에 오류가 발생하기 쉬운 Mutazyme II의 DNA 중합 효소를 사용하여 선택이러한 히드 록실 아민의 사용, mutator E.와 같은 다른 임의의 mutagenesis 기술에 비해 세포핵에 관해서는 무작위로 관심의 유전자에 통합됩니다 대장균의 변종 및 기타 오류가 발생하기 쉬운 DNA는 20 polyermases. 일반적으로 낮은 돌연변이 속도는 두 가지 이유가 더 바람직 경향이 있습니다. 첫째, 단백질 공학 thermostability은 일반적으로 비교적 적은 아미노산 대체 구성되어 있습니다. 높은 돌연변이 요금은 결론적으로 구조 misfolding 및 기능 차이가 발생할 수 있습니다 특정 분자에 극적으로 구조 변경이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 글리신과 프롤린 잔류의 설립은 알파 나선 구조 차에게 21를 중단 할 수 있습니다. 둘째, 높은 염기 변이 요금은 생물학적으로 운영 중지 된립니다 분자의 결과로, 조기 정지 codons를 통합의 가능성을 높일 수 있습니다. 일반적으로 낮은 돌연변이 속도가 선호됩니다 때문에 accumul의 낮은 오류 요금 결과적응 변이 ation 높은 돌연변이 속도가 중성 또는 해로운 변이 22를 생성하는 동안.
임의 mutagenesis의 각 라운드를 들어, 한 최적화해야하는 또 다른 중요한 변수는 심사 과정에서 사용되는 부화 온도를 포함한다. 실험 비 허용 온도의 선택은 상대적으로 어려운 것입니다. 우리는 처음에 10 살 부화 온도를 사용 ° C, PlyC의 비 허용 온도보다 높은 그러나 3000 돌연변이를 검사 한 후, 우리는 모든 유리한 변이를 식별 할 수 없습니다. 감독 진화 방법론은 순차적으로 첨가제 효과를 가지고 유익한 아미노산 대체를 식별로 구성 염두에두고, 그것은 그 거짓 - 탐지를 생성하는 기회를 증가하는 경우에도 덜 엄격한 온도가 심사 과정에서 사용되어야한다고 결정했다. 따라서 우리는 비 permiss 위의 몇도했다 부화 온도를 사용필자 온도와 rescreened 선택한 후보자는 거짓 - 반응을 배제합니다.
우리는 너무 온화한 아니라 부화 온도 활용하기로 결정 (≤ 1 ° C 낮은 비 허용 온도보다 높은)와 반대로 너무 가혹하지 않음 (≥ 5 ° 낮은 비 허용 온도보다 C 이상). 우리가이 특정 분석에 사용하기로 결정 이상적인 온도는 중간 12 살 ° C 실험적으로 결정이 아닌 허용 온도보다 높다. 중간 부화 온도를 사용하는 경우도 온화 온도를 선택하면 우리가 관찰 ~ 20 % (표 I)보다 훨씬 높은 허위 긍정적 인 인식 속도가 높아집니다. 또한, 너무 거칠다 부화 온도를 사용하여 궁극적으로는 크게 향상된 열 동작과 뮤턴트를 식별 할 수 없다는 될 수 있습니다. 예를 들어, ≥ 5 부화 온도를 사용하여 ° C는을 식별 할 수 없다는 결과 것이다29C3 돌연변이뿐만 아니라 심사의 첫 라운드 중에 선택한 다른 후보자의 대부분을 약속.
합계에서는, 우리는 강화 운동 안정성을 확보하기 위해 엔지니어링 bacteriolytic 효소에 대한 프로토콜을 제공합니다. 또한, 가열 단계없이이 같은 분석은, 촉매 활동을 증가 변이에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 촉매 활동 및 thermostability 모두를 보강하는 것은 어떤 치료 효소가 직면하는 중요한 발달 장애물입니다. 이 프로토콜의 세부 endolysin PlyC에만 해당하는 반면, 방법론은 몇 변경과 아무런 bacteriolytic 효소에 적용 할 수 있습니다. 우리는 상당한 크기의 분자 thermostability 증가를 생성 변이의 구현 및 식별의 결과로, 분석의 기능을 확인하는 mutagenesis 만의 첫 라운드에서 예비 결과를 발표했다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원을 Emilija Renke 자넷 유 감사하고 싶습니다. DCN은 국방의 미국학과 (DR080205, DM102823, OR09055 및 OR090059)에서 보조금으로 지원된다. RDH는 메릴랜드 농업 실험 역 세포 및 분자 생물학의 NIH 교육 교부금의 교부금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 | |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 | |
| Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 | |
| 96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 | |
| Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 | |
| Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 | |
| pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 | |
| pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |
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