thermostability 공학 분야에 해당 소설 감독 진화 방법은 bacteriolytic 효소 용으로 개발하고 결과적으로 확인되었습니다. 고온의 부화 후 야생 형 단백질에 비해 무작위 mutagenesis의 한 라운드, 발전 bacteriolytic 효소, PlyC 29C3는 두 번 잔류 활동보다 더 큰 표시 한 후.
감독 진화는 자연의 단백질과 연결되어 있지 않은 특정 속성을 얻기 위해 단백질을 처리하기 위해 자연 선택을 활용하는 방법으로 정의됩니다. 문학 성공적으로 분자 특이성과 촉매 하나를 변경하도록 지시 진화의 구현에 대한 많은 증거를 제공하고 있습니다. 대신 분자 공학에 대한 더 많은 합리적 기반 접근법의 지시 진화를 활용의 주요 이점은 2 상영 할 수 있습니다 변종의 볼륨과 다양성에 관한 것이다. 감독 진화 한 가지 가능한 응용 프로그램 등 endolysins 등 bacteriolytic 효소의 향상 구조 안정성을 포함한다. 인코딩 및 자손의 virions의 숙주 세포의 용해와 해방의 결과, 박테리아의 peptidoglycan (예 : 세포 벽)에 중요한 공유 결합을 hydrolyze하는 endolysins을 표현을 박테리오파지. 특히,이 효소는 extrinsically suscept에 용해를 유도 할 수있는 능력을 가지고파지의 부재와 나아가 였죠 박테리아는 체외에서와 치료 가능성 3-5에 대한 생체의 모두 확인되었습니다. 우리의 지시 진화 연구의 주제는 PlyCA 및 PlyCB subunits 6로 구성되어 있습니다 PlyC endolysin을 포함합니다. 정화되고 extrinsically 추가하면 PlyC holoenzyme 초 만에 그룹 streptococci (GAS)뿐만 아니라 다른 구균 그룹을 lyses 게다가 GAS 7에 대한 생체에서 확인되었습니다. 크게 상승 온도 부화 후 잔여 효소 반응 속도론을 모니터링하는 것은 PlyC이 효소의 추가 개발을 제한 할 수 있습니다 짧은 치료 수명을 제안, 45 ° C에서 갑자기 lytic 활동을 잃게 고유 한 증거를 제공합니다. 또한 연구 PlyCB의 subunit이 안정 반면, 열 안정성의 부족 만 PlyCA의 subunit에 대한 관찰 공개까지 ~ 90 ° C (게시되지 않은 관찰). PlyC뿐만 아니라, S가 있습니다endolysins의 thermolabile 특성을 설명하는 문학에 everal 예. 예를 들어, 황색 포도상 구균 endolysin LysK과 연쇄상 구균 pneumoniae endolysins 상병-1 및 PAL은 42에 자발적으로 활동을 잃게 ° C, 43.5 ° C와 50.2 ° C, 각각 8-10. 특정 시스템에서의 온도 현재까지 화학 반응의 속도를 관련 Arrhenius 방정식에 따르면, thermostability의 증가는 유통 수명 11 증가 상관 관계를합니다. 이 끝으로, 감독 진화는 자연 속에서 다양한 분자의 열 활동을 변경을위한 유용한 도구로 표시되었습니다,하지만이 기술은 bacteriolytic 효소의 연구에 성공적으로 악용되지 않았습니다 않습니다. 마찬가지로, antimicrobials의 특정 클래스의 구조 안정성을 진행 성공적으로 계정이 모두 존재합니다. 이 동영상에서는, 우리는 오류 PR를 사용하는 새로운 방법을 채택한 DNA 중합 효소는 효소의 운동 안정성의 증가 (그림 1) 상관 관계를 PlyC 구균의 endolysin의 PlyCA의 subunit에 돌연변이를 식별 할 수 96 잘 microtiter 플레이트 형식을 사용하여 최적의 심사에 이어. 임의 mutagenesis 중 하나 라운드 후 결과는 방법은 고온 처리 한 후 야생 유형 (WT) PlyC에 비해 두배 이상 잔류 활동을 유지 PlyC 변종을 생성하는 것이 좋습니다.
그림 1에 설명이 프로토콜은, 하나는 모든 bacteriolytic 효소의 thermostability을 높이기 위해 감독 진화를 활용 할 수있는 96 잘 microtiter 플레이트 방법론을 제공합니다. 향상을 생성 오류가 발생하기 쉬운 DNA의 중합 효소의 사용을 통해, 하나는 일반적으로 정전기 증가 구성된 분자 reorganizations로 인해 관심의 번역 bacteriolytic 분자의 전체 운동 안정성을 향상 무작위로 변이를 도입 할 수 disulphide 다리와 소수성이 상호 작용 분자 포장, 표면 전하 네트워크 또는 높은 oligomerization 상태 17-18 강화의 강화 수정. 염기 변이의 도입 후, 광범위한 심사 절차는 다음 열 유익한 변이를 식별하는 데 사용되었다. 여기에 제시된 대표 결과는 무작위 mutagenesis 중 하나 원형을 기반으로했다. 현실에서, 것을 제안했습니다임의 mutagenesis의 적어도 세 연속 발은 DNA 셔플 링 뒤에 리드 효소로 가장 강력한 돌연변이를 사용하여 각 감독 진화 열 행동 연구의 이러한 유형 2에 대한 적합합니다.
그것은이 프로토콜 운동 안정성을 증대 변이를 식별하는 동안,이 변종은 반드시 thermostability을 증가하지 않는 것이 이해하는 것이 중요합니다. 는 높은 온도에서 구조를 유지 할 수있는 능력이있는 경우 분자는 내열 간주됩니다. 그러나, 제시된 분석에서 돌연변이 lysates의 잔류 활동들은 처음 열처리 단계에서의 incubated되었습니다 그래서 하나는 19 refolding보다 향상된 thermostability을 촉진 변이에 대한 선택 될 수있는 동일한 온도에서 assayed되지 않습니다. 우리는 열 안정성은 표시대로 열 동작을 외삽 법에 의해 추정하는 동안, 사실 열 안정성이 biophys에 의해 경험적으로 측정해야이러한 원형 이색 성 (CD), 차동 스캐닝 열량 측정법 (DSC) 및 차동 검사 fluorimetry (DSF)와 같은 ICAL 방법. CD 및 DSF 실험에서 예비 데이터를 제시 방법에서 식별 여러 후보자가 실제로 진행 thermostability을 (데이터가 게재되지 않음) 표시 않는 것이 좋습니다.
여기에 제시된 방법은 PlyC로 증가 열 동작을 구현에만 수 있지만,이 같은 방법론은 또한 같은 버퍼, 돌연변이 요금, 난방 조건 및 표현 시스템과 같은 변수에 약간의 변경과 다른 bacteriolytic 효소에 열 활동을 강화하기 위해 고용 할 수 있습니다. 이 분석과 관련된 하나의 중요한 변수는 오류가 발생하기 쉬운 DNA의 중합 효소의 염기 변이 속도에 관한 것이다. 우리는 인해 특정 효소가와 편견의 최소 금액을 표시 제안 실험적 증거에 우리의 이동 진화 분석에 오류가 발생하기 쉬운 Mutazyme II의 DNA 중합 효소를 사용하여 선택이러한 히드 록실 아민의 사용, mutator E.와 같은 다른 임의의 mutagenesis 기술에 비해 세포핵에 관해서는 무작위로 관심의 유전자에 통합됩니다 대장균의 변종 및 기타 오류가 발생하기 쉬운 DNA는 20 polyermases. 일반적으로 낮은 돌연변이 속도는 두 가지 이유가 더 바람직 경향이 있습니다. 첫째, 단백질 공학 thermostability은 일반적으로 비교적 적은 아미노산 대체 구성되어 있습니다. 높은 돌연변이 요금은 결론적으로 구조 misfolding 및 기능 차이가 발생할 수 있습니다 특정 분자에 극적으로 구조 변경이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 글리신과 프롤린 잔류의 설립은 알파 나선 구조 차에게 21를 중단 할 수 있습니다. 둘째, 높은 염기 변이 요금은 생물학적으로 운영 중지 된립니다 분자의 결과로, 조기 정지 codons를 통합의 가능성을 높일 수 있습니다. 일반적으로 낮은 돌연변이 속도가 선호됩니다 때문에 accumul의 낮은 오류 요금 결과적응 변이 ation 높은 돌연변이 속도가 중성 또는 해로운 변이 22를 생성하는 동안.
임의 mutagenesis의 각 라운드를 들어, 한 최적화해야하는 또 다른 중요한 변수는 심사 과정에서 사용되는 부화 온도를 포함한다. 실험 비 허용 온도의 선택은 상대적으로 어려운 것입니다. 우리는 처음에 10 살 부화 온도를 사용 ° C, PlyC의 비 허용 온도보다 높은 그러나 3000 돌연변이를 검사 한 후, 우리는 모든 유리한 변이를 식별 할 수 없습니다. 감독 진화 방법론은 순차적으로 첨가제 효과를 가지고 유익한 아미노산 대체를 식별로 구성 염두에두고, 그것은 그 거짓 – 탐지를 생성하는 기회를 증가하는 경우에도 덜 엄격한 온도가 심사 과정에서 사용되어야한다고 결정했다. 따라서 우리는 비 permiss 위의 몇도했다 부화 온도를 사용필자 온도와 rescreened 선택한 후보자는 거짓 – 반응을 배제합니다.
우리는 너무 온화한 아니라 부화 온도 활용하기로 결정 (≤ 1 ° C 낮은 비 허용 온도보다 높은)와 반대로 너무 가혹하지 않음 (≥ 5 ° 낮은 비 허용 온도보다 C 이상). 우리가이 특정 분석에 사용하기로 결정 이상적인 온도는 중간 12 살 ° C 실험적으로 결정이 아닌 허용 온도보다 높다. 중간 부화 온도를 사용하는 경우도 온화 온도를 선택하면 우리가 관찰 ~ 20 % (표 I)보다 훨씬 높은 허위 긍정적 인 인식 속도가 높아집니다. 또한, 너무 거칠다 부화 온도를 사용하여 궁극적으로는 크게 향상된 열 동작과 뮤턴트를 식별 할 수 없다는 될 수 있습니다. 예를 들어, ≥ 5 부화 온도를 사용하여 ° C는을 식별 할 수 없다는 결과 것이다29C3 돌연변이뿐만 아니라 심사의 첫 라운드 중에 선택한 다른 후보자의 대부분을 약속.
합계에서는, 우리는 강화 운동 안정성을 확보하기 위해 엔지니어링 bacteriolytic 효소에 대한 프로토콜을 제공합니다. 또한, 가열 단계없이이 같은 분석은, 촉매 활동을 증가 변이에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 촉매 활동 및 thermostability 모두를 보강하는 것은 어떤 치료 효소가 직면하는 중요한 발달 장애물입니다. 이 프로토콜의 세부 endolysin PlyC에만 해당하는 반면, 방법론은 몇 변경과 아무런 bacteriolytic 효소에 적용 할 수 있습니다. 우리는 상당한 크기의 분자 thermostability 증가를 생성 변이의 구현 및 식별의 결과로, 분석의 기능을 확인하는 mutagenesis 만의 첫 라운드에서 예비 결과를 발표했다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 기술 지원을 Emilija Renke 자넷 유 감사하고 싶습니다. DCN은 국방의 미국학과 (DR080205, DM102823, OR09055 및 OR090059)에서 보조금으로 지원된다. RDH는 메릴랜드 농업 실험 역 세포 및 분자 생물학의 NIH 교육 교부금의 교부금으로 지원됩니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 |
Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 |
96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 |
Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 |
Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 |
pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 |
pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |