Termostabilite mühendisliği alanında belirli bir yeni yönlendirilmiş evrim yöntem bacteriolytic enzimler için geliştirilen ve sonuç olarak doğrulanmıştır. Yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon sonrasında yabani-tip protein ile karşılaştırıldığında rasgele mutagenez sadece bir yuvarlak, gelişmiş bir bacteriolytic enzim, PlyC 29C3, iki kez etkinlik kalıntı daha fazla görüntülenen sonra.
Yönlendirilmiş evrim doğada protein ile ilişkili olmayan belirli özelliklerini elde etmek için mühendislik proteinleri için doğal seleksiyon yararlanmak için bir yöntem olarak tanımlanır. Edebiyat başarıyla moleküler özgüllüğü ve kataliz 1 değiştirmek için yönlendirilmiş evrim uygulanmasına ilişkin sayısız örnekler vermiştir. Yerine moleküler mühendislik için daha rasyonel tabanlı yaklaşımların yönlendirilmiş evrim kullanan birincil avantajı 2 taranabilir varyantların hacmi ve çeşitliliği ile ilgilidir. Yönlendirilmiş evrim olası bir uygulaması gibi endolysins gibi bacteriolytic enzimler, iyileştirilmesi yapısal kararlılık gerektirir. Kodlamak ve döl virionlar ev sahibi hücre parçalama ve kurtuluş sonuçlanan, bakterilerin peptidoglikan (yani hücre duvarı) kritik bir kovalent bağ hidrolize endolysins ifade bakteriyofaj. Özellikle, bu enzimler dışsal Yatkınlık için lizis ikna yeteneğine sahipfaj yokluğunda ve ayrıca ible bakteriler, in vitro ve bunların terapötik potansiyel 3-5 için in vivo olarak doğrulanmıştır. Bizim yönlendirilmiş evrim çalışmanın konusu PlyCA ve PlyCB alt birimlerinin 6 oluşur PlyC endolysin, içerir. Saflaştırıldı ve dışsal olarak eklendiğinde, PlyC holoenzyme birkaç saniye içinde grubu streptokoklar (GAS) yanı sıra, başka streptokokal grupları lysis oluşumunu ve ayrıca GAZ 7 karşı in vivo olarak doğrulanmıştır. Anlamlı, yüksek sıcaklıklarda inkübasyon sonrası rezidüel enzim kinetiği izlenmesi PlyC Bu enzimin ek geliştirme sınırlayabilir kısa bir terapötik raf ömrü, düşündüren, 45 ° C'de aniden litik aktivite kaybeder o ayrı kanıt sağlar. Daha ileri çalışmalar PlyCB altbirim kararlı iken, termal kararlılık eksikliği ancak PlyCA alt ünitesi için gözlenen açığa kadar ~ 90 ° C (yayınlanmamış gözlem). PlyC ek olarak, s varendolysins arasında termolabil doğasını açıklamak literatürde everal örnekler. Örneğin, Staphylococcus aureus endolysin LysK ve Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 ve Pal 42 kendiliğinden etkinlik kaybetmek ° C, 43.5 ° C ila 50.2 ° C, sırasıyla 8-10. Belirli bir sistem içinde mevcut sıcaklık için bir kimyasal reaksiyon oranı ile ilgilidir Arrhenius denklemi göre, termostabilite bir artış raf ömrü 11 bir artış ile ilişkili olacaktır. Bu amaçla, yönlendirilmiş evrim doğada çeşitli moleküllerin termal aktivite değiştirmek için yararlı bir araç olduğu gösterilmiştir, ancak bu özel teknoloji bacteriolytic enzimlerin çalışması için başarıyla yararlanan olmuştur asla. Aynı şekilde, antimikrobiyaller bu özel sınıfın yapısal stabilite ilerliyor başarı hesapları tamamen varolmayan vardır. Bu videoda, biz bir hata-pr kullanan bir roman metodoloji istihdambir DNA polimeraz enzim kinetik stabilite artışı (Şekil 1) ile bağlantılıdır PlyC streptokok endolysin arasında PlyCA alt ünitesine mutasyonları tanımlamak için bir 96 oyuklu plaka formatı kullanılarak iyileştirilmiş bir tarama işlemi takip eder. Rastgele mutajenez sadece bir tur sonra Sonuçlar metodolojisi yüksek sıcaklık tedavi sonrası vahşi tip (WT) PlyC kıyasla iki kat daha fazla rezidüel aktivitesi korumak PlyC türevlerini üreten düşündürmektedir.
Şekil 1 'de özetlenen bu protokol, herhangi bir bacteriolytic termostabilite artırmaya yönelik evrim kullanmak olanak sağlayan bir 96 oyuklu plaka yöntemi sunar. Geliştirilmiş oluşturmak bir hata eğilimli DNA polimeraz kullanılarak, bir tipik olarak elektrostatik artan oluşan moleküler yeniden düzenlemeler nedeniyle ilgi tercüme bacteriolytic molekülü, genel olarak kinetik stabilitesini arttırmak rastgele mutasyonların tanıtmak için, disülfid köprü ve hidrofobik etkileşimler moleküler ambalaj, yüzey yükü ağlar veya daha yüksek bir oligomerizasyonun devletin 17-18 takviye gelişmiş değişiklikler. Nükleotid mutasyonu girişten sonra, kapsamlı bir tarama prosedürü ardından termal yararlı mutasyonları tanımlamak için kullanılmıştır. Burada sunulan temsilcisi sonuçlar rastgele mutajenez bir tur dayanmaktadır. Gerçekte, bu ileri sürülmüştürrastgele mutajenez en az üç ardışık tur, DNA shuffling ardından kurşun enzim olarak en güçlü mutant kullanarak her yönlendirilmiş evrim termal davranış bu tür çalışmalar 2 için uygundur.
Bu protokol kinetik kararlılık artırmak mutasyonlar tespit ederken, bu varyantlar ille termostabilite artış olmadığını anlamak önemlidir. Yüksek bir sıcaklıkta yapısı tutma yeteneğine sahip olduğunda bir molekül ısı ayarlı olarak kabul edilir. Ancak, sunulan bu tahlil içinde, mutant lizatları kalıntı aktivitesi başlangıçta ısıl işlem adımı sırasında inkübe edildi ve böylece bir 19 refolding yerine geliştirilmiş termostabilite desteklemek mutasyon için seçilerek olabilir ki, aynı sıcaklıkta test edilmemiştir. Biz termal istikrarın bir göstergesi olarak termal davranış extrapolating edilirken, gerçek termal stabilite Biophys ampirik olarak ölçülmesi gerekirdairesel dikroizm (CD), diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC) ve diferansiyel tarama fluorimetry (DSF) gibi ical yöntemleri. CD ve DSF deneyler Ön veriler sundu metodolojisi tanımlanan birkaç aday gerçekten ilerledi termostabilite (veriler gösterilmemiştir) görüntülemek öneririz.
Burada sunulan metodoloji PlyC yükselmiştir termal davranışı uygulamak için belirli olsa da, bu aynı metodoloji ayrıca böyle tamponlar, mutasyon oranları, ısıtma koşulları ve ifade sistemleri gibi değişkenler için bazı küçük değişiklikler ile diğer bacteriolytic enzimler için termal aktivite geliştirmek için istihdam edilebilir. Bu tahlil ile ilişkili bir önemli değişken hata eğilimli DNA polimeraz nükleotid mutasyon oranı ile ilgilidir. Biz nedeniyle bu özel enzim ile önyargı az miktarda görüntüler gösteren deneysel kanıtlar bizim yönlendirilmiş evrim tayininde hataya Mutazyme II DNA polimeraz kullanmayı seçtiBu tür hidroksilamin kullanımı, mutator E. gibi diğer rasgele mutajenez teknikleri ile karşılaştırıldığında nükleotid ilişkin rasgele ilgilenilen genin dahil edilmiştir coli suşları ve diğer hata eğilimli DNA 20 polyermases. Genel olarak, düşük bir mutasyon oranları iki nedenden dolayı daha fazla arzu edilen olma eğilimindedir. İlk olarak, protein mühendisliği ile termostabilite tipik olarak nispeten daha az amino asit ikamesine oluşur. Yüksek mutasyon oranları kesin yapısal misfolding ve fonksiyonel farklılıklar neden olabilir belirli moleküllere önemli yapısal değişikliklere neden olabilir. Örneğin, glisin, prolin kalıntıları eklenmektedir alfa sarmal ikincil yapılar 21 bozabilir. İkincisi, yüksek nükleotid mutasyon oranları biyolojik olarak inaktif kesilmiş moleküller ile sonuçlanan, erken durdurmak kodonlar içeren şansını artırmak. Genel olarak, düşük bir mutasyon oranlar tercih edilir, çünkü accumul daha düşük hata oranı sonucunuadaptif mutasyon ation yüksek mutasyon oranları nötr veya zararlı mutasyonların 22 üretirken.
Rastgele mutajenez her turu için bir optimize gereken başka bir kritik değişken tarama işlemi sırasında kullanılan inkübasyon sıcaklığı içerir. Deneysel olmayan ılımlı sıcaklık seçimi nispeten zordur. Biz başlangıçta 10 olan bir inkübasyon sıcaklığı kullanılan ° C, PlyC-olmayan müsamahakâr sıcaklığından daha yüksek ise 3.000 mutantlar eleme sonrasında, herhangi bir faydalı mutasyonların tespit koyamadık. Yönlendirilmiş evrim yöntemleri sırayla additif etkileri vardır faydalıdır aminoasit değişikliğini tespit oluşmaktadır akılda tutarak, bunun yanlış pozitif üretme şansı artmış olsa bile daha az katı bir sıcaklık tarama sürecinde kullanılması gerektiğini tespit edilmiştir. Bu nedenle, biz sadece sigara-permiss C'nin birkaç derece üzerinde olduğu bir inkübasyon sıcaklığı kullanılırive sıcaklık ve rescreened seçilen adayların yanlış pozitif ekarte etmek.
Biz çok ılıman değildi bir inkübasyon sıcaklığı kullanmaya karar verdiler (≤ 1 ° C düşük olmayan müsamahakar sıcaklığından daha yüksek) ve tersine çok sert değil (≥ 5 ° düşük olmayan müsamahakar sıcaklığından daha yüksek C). Biz özellikle bu deneyde kullanmaya karar ideal sıcaklık ılımlı 2 ° C idi deneysel belirlenen non-müsamahakar sıcaklığından daha yüksek. Bir orta sıcaklıkta inkübasyon kullanıldığında çok hafif bir sıcaklık seçme gözlediğimiz ~% 20 (Tablo I) çok daha yüksek bir yanlış pozitif oran kimlik neden olur. Ayrıca, çok sert bir inkübasyon sıcaklığı kullanarak sonuçta önemli ölçüde geliştirilmiş termal davranışı ile mutantlar belirlemek için yetersizlik neden olabilir. Örneğin, ≥ 5 inkübasyon sıcaklığı kullanarak ° C tanımlamak için yetersizlik sonuçlandı olurdu29C3 mutant yanı sıra tarama ilk turda seçilen diğer adayların çoğunluğu umut.
Toplamı, biz gelişmiş kinetik kararlılık elde etmek için mühendislik bacteriolytic enzimler için bir protokol sağlar. Üstelik, bu ısıtma adımlar olmadan aynı tahlil, katalitik aktivitesini arttırmak mutasyonları tespit etmek amacıyla kullanılabilir. Katalitik aktivite ve termostabilite hem Augmenting herhangi bir terapötik enzim bakan önemli bir gelişimsel engeldir. Bu protokolün ayrıntılar endolysin PlyC özgü da, metodoloji sadece birkaç değişiklik ile herhangi bir bacteriolytic enzim için adapte edilebilir. Biz önemli büyüklükte moleküler termostabilite bir artış oluşturmak mutasyonların uygulanması ve kimlik sonuçlanan testin işlevsellik doğrular mutagenez yalnızca ilk turda alınan ön sonuçlarını sundu.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar teknik yardım Emilija Renke ve Janet Yu teşekkür etmek istiyorum. DCN Savunma Amerika Birleşik Devletleri Bölümü (DR080205, DM102823, OR09055 ve OR090059) hibe tarafından desteklenmektedir. RDH Maryland Tarım Deneme İstasyonu ve Hücre ve Moleküler Biyoloji bir NIH Eğitim Grant bir hibe ile desteklenmektedir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 |
Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 |
96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 |
Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 |
Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 |
pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 |
pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |